單細胞蛋白組Abseq聯(lián)合流式技術(shù)在解鎖腫瘤與感染免疫差異中的應(yīng)用
在科研領(lǐng)域，單細胞蛋白組技術(shù)憑借其精準解析單個細胞蛋白表達特征的優(yōu)勢，成為探究免疫機制、挖掘疾病生物標志物的核心工具。其中，Abseq單細胞蛋白組技術(shù)表現(xiàn)突出，能夠?qū)崿F(xiàn)對單細胞水平蛋白表達的高效、精準檢測，為復(fù)雜疾病的機制研究提供關(guān)鍵支撐。在Nature的一項重要研究中，科研人員充分發(fā)揮Abseq單細胞蛋白組技術(shù)的獨特優(yōu)勢，結(jié)合流式分析技術(shù)，取得了突破性發(fā)現(xiàn)——成功鑒定出腫瘤特異的Treg細胞，并確定了其生物標志物，這一成果為未來腫瘤靶向治療帶來了新的曙光。
值得一提的是，在這項研究中，Abseq單細胞蛋白組技術(shù)與流式分析技術(shù)發(fā)揮了關(guān)鍵作用，二者配合默契、相得益彰。大量實驗結(jié)果顯示，兩種技術(shù)相互驗證，為研究結(jié)果提供了堅實的支撐。其中還在單細胞RNA測序樣本處理環(huán)節(jié)，全部采用流式分選技術(shù)進行樣本富集，這一操作不僅顯著提升了單細胞數(shù)據(jù)分析的精度，還有效節(jié)約了測序成本。而Abseq單細胞蛋白組技術(shù)與流式技術(shù)強強聯(lián)合，為單細胞研究打造了一套全方位、多維度的解決方案，誠邀廣大科研、臨床及工業(yè)領(lǐng)域的用戶踴躍試用！
接下來，詳細介紹這篇發(fā)表在Nature期刊上的文章——“Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation”。該研究對頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）以及部位匹配的非惡性炎癥口腔粘膜（OM）的免疫特征展開了系統(tǒng)性分析。研究過程中，科研人員發(fā)現(xiàn)了一群獨特的腫瘤特異Treg亞群。這群細胞具有顯著的免疫抑制特性，能夠?qū)CR信號做出應(yīng)答，并且處于活躍增殖狀態(tài)。更為重要的是，研究團隊借助Abseq技術(shù)創(chuàng)新性地鑒定出了該亞群的生物標志物，這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤精準治療開辟了全新的思路。
免疫療法在癌癥治療領(lǐng)域已取得了令人矚目的成功，然而，其發(fā)展之路并非一帆風順，仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。其中，一個亟待解決的問題是，免疫療法所靶向的通路并非腫瘤專屬，在其他組織微環(huán)境中同樣存在。盡管目前已有大量研究聚焦于腫瘤微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，但我們對腫瘤特異的免疫變化依然知之甚少，這在一定程度上限制了免疫療法在腫瘤治療中的精準應(yīng)用和進一步發(fā)展。
（1）單細胞蛋白組與RNA測序聯(lián)合技術(shù)
（2）流式分析技術(shù)
1. OM和HNSCC的免疫表型趨于一致
在腫瘤組織中，功能衰竭的T細胞和Treg細胞往往被視為抗腫瘤免疫反應(yīng)失效的關(guān)鍵因素，且T細胞的效應(yīng)功能與抗原呈遞細胞（APCs，Antigen Presenting Cells）緊密相關(guān)。為深入探究相關(guān)免疫機制，作者運用兩組包含30個參數(shù)的高維流式panel，對OM和HNSCC組織及血液中的免疫細胞圖譜進行了深度剖析。
研究結(jié)果令人意外，OM和HNSCC組織的免疫表型竟基本相似。在CD45+活細胞中，CD3+ T細胞、CD19+ B細胞以及CD56+ NK細胞的比例，還有CD4/CD8比例都大致相同（Fig 1a）。在APC細胞方面，cDC2s、DC3及CD16+非常規(guī)單核細胞的比例在OM和HNSCC組織中也基本一致，不過CD141+ cDC1s在HNSCC腫瘤組織中的比例略低（Fig 1b）。
為了精準鑒定特定免疫亞群之間的差異，作者借助了FAUST這一機器算法。該算法能夠以無監(jiān)督的方式發(fā)現(xiàn)并注釋統(tǒng)計上相關(guān)的細胞表型。結(jié)果顯示，在T細胞panel中，HNSCC組織中富集了一個CD8+ T細胞亞群和四個CD4+ Treg亞群；在APC細胞panel中，HNSCC組織中富集了CD40及PD-L1共表達的CD14+細胞以及cDC2s、DC3細胞。
2. 分析腫瘤富集的APC與T細胞之間的細胞通訊
為進一步探究上述免疫細胞的一致性與區(qū)別，作者采用了單細胞RNA測序技術(shù)，不僅發(fā)現(xiàn)了與流式結(jié)果相一致的免疫表型，還鑒定出了腫瘤特有的轉(zhuǎn)錄特征和蛋白表達特征。隨后，作者運用NicheNet方法對腫瘤特異性的T細胞和APC細胞通訊展開了研究。
研究發(fā)現(xiàn)，HNSCC腫瘤T-APC細胞通訊中富集的配體受體相互作用情況如下：ICOS配體通過ICOS發(fā)揮作用，IL-18通過IL18-R1發(fā)揮作用，IL1B通過IL-1受體1型及2型發(fā)揮作用。
鑒于流式和單細胞RNA測序（scRNA-seq）均顯示HNSCC腫瘤Tregs細胞存在差異，作者進一步對Treg-APC的相互作用進行了驗證。通過流式分析發(fā)現(xiàn)，IL1R1（在T細胞與APC通訊中富集）特異性地表達在腫瘤浸潤的Treg細胞上（Figure 2a）。幾乎所有的IL1R1+ T細胞都共表達ICOS、IL-18R1以及趨化因子受體CXCR6（Figure 2b）。
3. IL1R1+ Treg細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組與蛋白組特征分析
為了更清晰地區(qū)分腫瘤浸潤的IL1R1+ Treg細胞和IL1R1- Treg細胞，作者從OM、HNSCC以及外周血中分選了Treg細胞，并結(jié)合免疫響應(yīng)基因panel進行單細胞RNA測序。
結(jié)果顯示，腫瘤中的IL1R1+ Treg細胞（Figure 3a，橙色亞群）和IL1R1- Treg細胞（Figure 3a，藍色亞群）各自形成了獨立的亞群，與外周血Treg細胞存在明顯差異。在IL1R1+ Treg細胞中，選擇性富集了超過50個轉(zhuǎn)錄本（Figure 3b），其中包括TNFRSF18（編碼GITR）和TNFRSF9（編碼4-1BB）；這類細胞在蛋白水平也呈現(xiàn)出特異性表達特征，表明IL1R1+ Treg細胞代表了腫瘤浸潤Treg細胞中一群具有獨特轉(zhuǎn)錄組特征的免疫亞群。
4. IL1R1+ Treg細胞高度抑制性的功能研究
在CD8+ T細胞及CD4+ T細胞的體外增殖抑制實驗中，IL1R1+ Treg細胞展現(xiàn)出了比IL1R1- Treg細胞更有效的抑制效果（Figure 4a）。另外，通過anti-CD3、anti-CD28和anti-CD2磁珠刺激，腫瘤浸潤IL1R1+ Treg細胞中IL1R1的表達在第1天升高，第2-3天下降（Figure 4b）。這一現(xiàn)象提示，IL1R1+ Treg細胞能夠應(yīng)答TCR信號并調(diào)控IL1R1的表達。
為進一步研究腫瘤浸潤IL1R1+ Treg細胞應(yīng)答激活信號的免疫反應(yīng)，作者利用佛波酯（PMA）及離子霉素進行短時間刺激，然后運用單細胞轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合Abseq膜蛋白測序技術(shù)，系統(tǒng)分析了這類細胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組變化。對CD4+ T細胞及Treg細胞進行無監(jiān)督聚類分析后，結(jié)果顯示存在三個Treg亞群：IL1R1-、IL1R1+及活躍增殖的IL1R1+ Treg細胞。
PMA及離子霉素刺激后，Treg細胞的差異表達蛋白及差異表達基因情況如圖Figure 5a-b所示。例如，這類細胞高表達TNFRSF9及CTLA4轉(zhuǎn)錄本，并且通過Abseq技術(shù)檢測證實，其CTLA4蛋白顯著高表達。這表明IL1R1+ Treg細胞處于激活狀態(tài)且具有功能活性，并且存在一個活躍增殖的亞群。
通過Abseq單細胞膜蛋白檢測結(jié)果，作者成功鑒定出一組生物標記物，能夠唯一地識別IL1R1+ Treg細胞。僅使用2個膜表面蛋白，就可以從組織和外周血所有CD45+的免疫細胞中標記出這類細胞。并且通過流式分析驗證了標志物的特異性：幾乎所有的CD45+IL1R1+ICOS+細胞都是Treg細胞（Figure 6a）。這一發(fā)現(xiàn)依托Abseq技術(shù)的精準蛋白檢測能力，為未來靶向腫瘤特異性Treg細胞的治療提供了全新的思路和靶點。
最后，作者通過實驗驗證并結(jié)合公開的scRNA-seq數(shù)據(jù)集（涵蓋19種不同的腫瘤類型）分析發(fā)現(xiàn)，IL1R1+ Treg細胞并非僅特異性存在于HNSCC腫瘤中，而是以不同比例分布于各種實體腫瘤中。清除腫瘤浸潤性Treg細胞被認為是一種極具前景的抗腫瘤治療方法，而該研究借助Abseq技術(shù)鑒定出的腫瘤特異Treg細胞生物標志物，為靶向腫瘤特異Treg細胞、同時不影響其他Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)功能提供了可能，為腫瘤免疫治療的精準化發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
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