在 3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，類(lèi)器官憑借其模擬體內(nèi)器官結(jié)構(gòu)與功能的優(yōu)勢(shì)，成為研究發(fā)育、疾病機(jī)制及藥物篩選的核心模型。
然而，類(lèi)器官的三維結(jié)構(gòu)也為觀測(cè)帶來(lái)挑戰(zhàn) —— 傳統(tǒng)切片成像破壞樣本完整性，常規(guī)顯微鏡難以穿透厚樣本。
“類(lèi)器官 + 組織透明化 + 光片顯微鏡” 的技術(shù)組合，恰好破解了這一難題。本文結(jié)合三篇核心文獻(xiàn)，從文獻(xiàn)簡(jiǎn)介、組織透明化方法、光片成像方案、分析結(jié)果四個(gè)維度，詳細(xì)拆解這項(xiàng)技術(shù)的落地應(yīng)用，為科研人員提供實(shí)用參考。
 
腫瘤類(lèi)器官藥物篩選 —— 單細(xì)胞水平解析藥物療效差異
01文獻(xiàn)簡(jiǎn)介
發(fā)表于《BMC Cancer》（2024）的《A spheroid whole mount drug testing pipeline with machine-learning based image analysis identifies cell-type specific differences in drug efficacy on a single-cell level》，聚焦腫瘤微環(huán)境中 “腫瘤細(xì)胞 - 成纖維細(xì)胞” 相互作用對(duì)藥物響應(yīng)的影響。研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了 KP-4 胰腺癌細(xì)胞與 CCD-1137Sk 成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)類(lèi)器官模型，開(kāi)發(fā)了一套從類(lèi)器官制備、透明化、3D 成像到深度學(xué)習(xí)分析的完整流程，在單細(xì)胞水平揭示了不同細(xì)胞類(lèi)型對(duì)藥物（紫杉醇、阿霉素）的差異性響應(yīng)。
02組織透明化方法
該研究針對(duì)腫瘤類(lèi)器官（直徑可達(dá) 500μm）的厚樣本特性，采用甘油基光學(xué)透明化技術(shù)，具體步驟如下：
1.樣本預(yù)處理：類(lèi)器官經(jīng) 4% 多聚甲醛（PFA）固定 1 小時(shí)后，用含 1% 胎牛血清（FBS）的 PBS 清洗，再用 0.5M 甘氨酸淬滅殘留固定劑，避免熒光信號(hào)干擾。
2.滲透增強(qiáng)：將類(lèi)器官置于含 0.2% Triton X-100、0.3M 甘氨酸、20% DMSO 的穿透緩沖液中孵育 30 分鐘，為后續(xù)抗體滲透和透明化試劑擴(kuò)散鋪路。
3.透明化處理：可平衡類(lèi)器官內(nèi)部與外部環(huán)境的折射率，顯著降低光散射，確保激光能穿透 500μm 厚的類(lèi)器官，同時(shí)避免樣本收縮或變形。
4.驗(yàn)證環(huán)節(jié)：通過(guò)對(duì)比 “透明化類(lèi)器官的光學(xué)切片” 與 “傳統(tǒng)冷凍切片” 的熒光信號(hào)（Ki-67 增殖標(biāo)記、Cleaved Caspase-3 凋亡標(biāo)記），證明透明化后不同深度（50μm、250μm、500μm）的細(xì)胞標(biāo)記率與冷凍切片無(wú)顯著差異，驗(yàn)證了透明化的可靠性。

03成像方法
樣本掛載：透明化后的類(lèi)器官置于含 88% 甘油的 Ibidi μ-slide 中，平衡溫度后成像，避免樣本移動(dòng)或脫水。
成像參數(shù)：采用 20× 水浸物鏡（NA 0.75），激光波長(zhǎng)覆蓋 405nm（DRAQ5 核染）、488nm（熒光抗體）、561nm（壞死標(biāo)記），z 軸步長(zhǎng) 1μm，激光強(qiáng)度控制在 1-2% 以減少光毒性，同時(shí)開(kāi)啟 z 補(bǔ)償功能，抵消深度依賴的信號(hào)衰減。
數(shù)據(jù)兼容性：也可適配光片顯微鏡的多視角成像需求 —— 若改用光片顯微鏡，僅需調(diào)整樣本掛載方式（如 FEP 管固定），即可實(shí)現(xiàn)更快的成像速度。
 
04分析結(jié)果
類(lèi)器官生長(zhǎng)與藥物響應(yīng)特征：
共培養(yǎng)類(lèi)器官（KP-4+CCD-1137Sk）比 KP-4 單培養(yǎng)類(lèi)器官生長(zhǎng)更快，經(jīng)紫杉醇、阿霉素處理后，總細(xì)胞數(shù)仍高于單培養(yǎng)組，初看似乎 “共培養(yǎng)增強(qiáng)耐藥性”。
但單細(xì)胞水平分析揭示：成纖維細(xì)胞是耐藥核心——CCD-1137Sk 成纖維細(xì)胞對(duì)兩種藥物的耐受性顯著高于 KP-4 腫瘤細(xì)胞，說(shuō)明共培養(yǎng)未增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性，反而可能通過(guò)旁分泌信號(hào)增加其敏感性。
空間分布特征：
通過(guò) 3D 殼層分析（將類(lèi)器官分為內(nèi)、中、外三層），發(fā)現(xiàn)未處理組中 90% 的增殖細(xì)胞（Ki-67+）位于中外層，50-60% 的凋亡細(xì)胞位于核心；藥物處理后，共培養(yǎng)類(lèi)器官核心區(qū)域的增殖細(xì)胞減少更顯著，而單培養(yǎng)類(lèi)器官的凋亡細(xì)胞主要集中在外層，提示微環(huán)境影響藥物在類(lèi)器官內(nèi)的滲透與作用。

乳腺類(lèi)器官動(dòng)態(tài)觀測(cè) —— 
光片顯微鏡追蹤發(fā)育與信號(hào)變化
 
01文獻(xiàn)簡(jiǎn)介
發(fā)表于《Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia》（2025）的《Live-cell imaging of mammary organoids using light sheet microscopy》，針對(duì)乳腺類(lèi)器官的動(dòng)態(tài)發(fā)育研究需求，優(yōu)化了 “類(lèi)器官培養(yǎng) - 透明化 - 光片成像” 的全流程。研究以小鼠乳腺類(lèi)器官（含 EKAREV-NLS 熒光報(bào)告基因或 H2B-mCherry 核標(biāo)記）為模型，開(kāi)發(fā)了多視角和倒置兩種光片顯微鏡的樣本掛載方案，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá) 72 小時(shí)的低光毒性實(shí)時(shí)成像，清晰捕捉乳腺類(lèi)器官分支形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖及信號(hào)分子動(dòng)態(tài)變化，為乳腺發(fā)育生物學(xué)提供了全新觀測(cè)工具。
02組織透明化方法
考慮到乳腺類(lèi)器官（部分為囊性結(jié)構(gòu)）的脆弱性，研究采用溫和透明化策略，避免破壞樣本完整性：
1.類(lèi)器官包埋：若需長(zhǎng)期存儲(chǔ)或高分辨率成像，采用Matrigel / 膠原 I 基質(zhì)保留策略—— 類(lèi)器官嵌入含 15mg/mL 基底膜提取物（BME）和 1.5mg/mL 膠原 I 的 3D 基質(zhì)。
2.類(lèi)器官組織透明化：僅用少量 88% 甘油浸潤(rùn)，既維持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，又輕度降低光散射，透明化后樣本可在 4℃存儲(chǔ) 1 周，-20℃存儲(chǔ) 6 個(gè)月。
3.關(guān)鍵驗(yàn)證：對(duì)比 “無(wú)透明化活細(xì)胞成像” 與 “透明化固定成像” 的 Ki-67 標(biāo)記率，兩者無(wú)顯著差異（活細(xì)胞組 54.37±1.68% vs 透明化組 47.44±1.98%），證明透明化不影響細(xì)胞狀態(tài)評(píng)估。
 
03光片顯微鏡成像方法
研究核心采用多視角光片顯微鏡（ZEISS Lightsheet 7）和倒置光片顯微鏡（Luxendo TruLive3D），針對(duì)不同乳腺類(lèi)器官類(lèi)型設(shè)計(jì)專(zhuān)屬方案：
1. 多視角光片顯微鏡（適用于大體積乳腺類(lèi)器官，直徑 > 300μm）
樣本掛載：類(lèi)器官嵌入 FEP 管（內(nèi)徑 1.3mm，壁厚 0.15mm）中的 ECM 凝膠柱，垂直懸掛。
成像參數(shù)：采用 10× 和 20× 檢測(cè)物鏡，光片厚度 6μm，多視角（4 個(gè)角度）成像后拼接，z 軸步長(zhǎng) 2μm。 
優(yōu)勢(shì)：可捕捉類(lèi)器官 360° 全景，解決大體積樣本的 “盲區(qū)” 問(wèn)題。
2. 倒置光片顯微鏡
樣本掛載：類(lèi)器官置于 V 型 FEP 孔中，底部鋪薄層高濃度 ECM 凝膠（5μL Matrigel）。
成像參數(shù)：采用 20× 水浸物鏡，雙光片照明，z 軸步長(zhǎng) 1μm。
04分析結(jié)果
乳腺類(lèi)器官發(fā)育動(dòng)態(tài)：
單細(xì) - 胞來(lái)源的乳腺類(lèi)器官（H2B-mCherry 核標(biāo)記），光片成像清晰記錄分支延伸速度（平均 2.5μm/h）和方向，發(fā)現(xiàn)分支優(yōu)先向 ECM 凝膠疏松區(qū)域生長(zhǎng)，提示基質(zhì)硬度影響發(fā)育方向。
藥物 / 因子處理響應(yīng)：
加入 2.5nM FGF2 后，乳腺類(lèi)器官分支數(shù)量在 6 天內(nèi)增加 3 倍，光片成像追蹤到 FGF2 誘導(dǎo)的 “頂端細(xì)胞增殖 - 基底細(xì)胞遷移” 協(xié)同過(guò)程；而加入 ERK 抑制劑后，分支延伸停滯，且頂端細(xì)胞 ERK 活性降至基線水平，驗(yàn)證了 ERK 信號(hào)的關(guān)鍵作用。
成像質(zhì)量與光毒性：
連續(xù) 72 小時(shí)成像后，乳腺類(lèi)器官的存活率仍保持 80% 以上（Live-or-Dye 壞死標(biāo)記率 < 5%），遠(yuǎn)高于共聚焦顯微鏡（48 小時(shí)存活率 < 50%），證明光片顯微鏡的低光毒性優(yōu)勢(shì)；且成像分辨率足以區(qū)分單個(gè)細(xì)胞的核形態(tài)（如成纖維細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)核 vs 上皮細(xì)胞的圓形核）。
多類(lèi)型類(lèi)器官通用成像 —— 
果糖 - 甘油透明化與光片技術(shù)的普適方案
 
01文獻(xiàn)簡(jiǎn)介
發(fā)表于《Nature Protocols》（2019）的《High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids》，提出了一套適用于人腸道、肝臟、乳腺、氣道、腎臟類(lèi)器官的通用 3D 成像 protocol。研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)了低毒性、高透明效果的 “果糖 - 甘油透明化試劑”，結(jié)合共聚焦、多光子和光片顯微鏡，實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞骨架到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的高分辨率成像，且透明化樣本可長(zhǎng)期存儲(chǔ)，為不同來(lái)源類(lèi)器官的標(biāo)準(zhǔn)化成像提供了 “操作手冊(cè)” 級(jí)方案，已被廣泛應(yīng)用于疾病建模和藥物篩選研究。
02組織透明化方法
該研究的核心創(chuàng)新是果糖 - 甘油（FG）透明化試劑，具體配方與流程具有普適性：
1.透明化流程：
PFA固定：類(lèi)器官經(jīng) 4% PFA 固定 45 分鐘（囊性類(lèi)器官可縮短至 30 分鐘，避免塌陷），用含 0.1% Tween 20 的 PBS（PBT）清洗 3 次。
免疫標(biāo)記：（一抗 4℃孵育過(guò)夜，二抗 4℃孵育過(guò)夜），用器官清洗緩沖液（OWB：含 1% BSA、0.1% Triton X-100 的 PBS）充分清洗，去除未結(jié)合抗體。
透明化處理，室溫孵育 20 分鐘，即可成像；若需存儲(chǔ)，可直接置于 - 20℃，6 個(gè)月內(nèi)熒光信號(hào)無(wú)顯著衰減。
2.優(yōu)勢(shì)對(duì)比：
類(lèi)器官透明化后的 DAPI 熒光強(qiáng)度高 3 倍，且透明化后類(lèi)器官無(wú)收縮。
與無(wú)透明化相比：可使成像深度提升 2 倍（無(wú)透明化僅能穿透 100μm vs 透明化可穿透 200-500μm），且深層細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度衰減率降低 50%。
 03光片顯微鏡成像方法
研究針對(duì)不同類(lèi)器官特性，適配光片顯微鏡（Zeiss Light Sheet Z.1） 的標(biāo)準(zhǔn)化方案：
樣本掛載（光片專(zhuān)用）：
類(lèi)器官與低熔點(diǎn)瓊脂糖（0.4%）+ FG 試劑混合（40℃下制備），吸入玻璃毛細(xì)管（直徑 1.5mm），4℃冷卻凝固后，將毛細(xì)管置于光片成像 chamber 中，chamber 內(nèi)填充 FG 試劑，避免樣本脫水。
成像參數(shù)：
 10×（NA 0.2）和檢測(cè)物鏡 20×（NA 1.0，適配 透明化試劑的折射率），光片厚度 6μm，雙光片照明以減少陰影，z 軸步長(zhǎng) 1-2μm，根據(jù)類(lèi)器官大小調(diào)整成像范圍（腸道類(lèi)器官需 z 范圍 500μm，氣道類(lèi)器官需 300μm）。

多模態(tài)兼容：
若類(lèi)器官含熒光報(bào)告基因（如 H2B-mNeonGreen），可直接成像；若需免疫標(biāo)記，可在透明化前完成，透明化過(guò)程不影響抗體結(jié)合效率（如 E - 鈣粘蛋白標(biāo)記率與未透明化組一致，均為 95% 以上）。
04分析結(jié)果
| 三維可視化：組織透明化后類(lèi)器官三維成像相較于二維成像的優(yōu)勢(shì)，能夠清晰呈現(xiàn)類(lèi)器官樣本的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。
 
| 成像深度與熒光強(qiáng)度加深：透明化步驟后，與未進(jìn)行透明化處理的樣本相比，類(lèi)器官成像的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，且 z 軸方向的成像穿透深度也有所提升。
 
| 3D細(xì)胞亞型定量分析：能夠支持細(xì)胞分割算法對(duì)整個(gè)類(lèi)器官中細(xì)胞的數(shù)量以及不同細(xì)胞亞型中各類(lèi)細(xì)胞標(biāo)志物的存在情況進(jìn)行定量分析
類(lèi)器官組織透明化解決方案
 
01組織透明化的高深度、高質(zhì)量，高通量類(lèi)器官平臺(tái)
 
快速透明化—僅需5-10min即可透明化500um 厚的樣品
溫和光學(xué)透明化—對(duì)熒光標(biāo)記組織進(jìn)行透明化用于 3D 成像后，對(duì)檢測(cè)靈敏度或樣品形態(tài)的影響小
工作流程兼容性—無(wú)需其他設(shè)備或儀器即可輕松實(shí)現(xiàn)
平臺(tái)兼容性—與大多數(shù)熒光染料和標(biāo)準(zhǔn)熒光成像儀器兼容
光片顯微平臺(tái)—實(shí)現(xiàn)高分辨類(lèi)器官三維可視化