方案摘要：本方案結合了Pipetty電動移液器的產(chǎn)品優(yōu)勢，通過精準移取實驗試劑與樣品，保障核酸提取、PCR反應體系配制等關鍵步驟的準確性與重復性，減少人為操作誤差導致的檢測偏差，實現(xiàn)對豬臨床樣品中副豬格拉瑟菌的快速、靈敏、特異性檢測，為臨床疫病診斷與防控提供可靠技術支撐。
 
方案詳情：
一、實驗原理
副豬格拉瑟菌為革蘭氏陰性菌，是引起豬格拉瑟氏病的病原體，可導致豬出現(xiàn)關節(jié)炎、胸膜炎、腦膜炎等癥狀，對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重。本實驗基于熒光實時PCR技術，利用副豬格拉瑟菌特異性引物與MGB探針，針對病原體基因組中保守序列進行靶向擴增。在PCR擴增過程中，探針與目的片段特異性結合，隨著擴增循環(huán)進行，熒光信號不斷累積，通過實時熒光PCR儀檢測熒光信號變化，可實現(xiàn)對樣品中副豬格拉瑟菌的定性檢測。
 
二、‌實驗準備
1、儀器設配
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 自動化核酸提取儀；
③ 實時熒光PCR儀；
④ 臺式低溫高速離心機(最大離心力12000g以上)。
 
2、試劑和材料
① 副豬格拉瑟菌實時熒光PCR擴增用上、下游引物及探針序列；
② 陽性對照；
③ 陰性對照；
④ 核酸提取試劑盒。
三、實驗步驟
1、采用核酸提取試劑盒或自動化核酸提取儀提取豬臨床樣品中的副豬格拉瑟菌DNA。提取過程中，使用Pipetty電動移液器，精準移取提取試劑及樣品，嚴格按照試劑盒說明書操作，避免DNA降解或污染。提取完成后，若在2h內(nèi)進行檢測，可將DNA置于冰上臨時保存；若需長時間存放，應置于-20℃冰箱中保存，防止DNA降解。
 
2、每個樣品設置3個重復孔，同時設置陽性對照、陰性對照各3個重復孔，按以下比例配制25μL反應體系，所有試劑均通過Pipetty電動移液器精準移�。�
10×PCR緩沖液（含Mg²⁺）            2.5μL
dNTPs混合物                          2.0μL                
上游引物（FQ-P1）                    0.5μL
下游引物（FQ-P2）                    0.5μL
MGB探針                              0.5μL
ExTag DNA聚合酶                      0.25μL
滅菌雙蒸水                           16.75μL
DNA模板                              2.0μL
合計                                  25μL
體系配制完成后，輕柔振蕩混勻，置于臺式低溫高速離心機中，以3000r/min離心30s，使液體全部聚集于管底，避免氣泡影響熒光信號采集。按樣品順序?qū)⒎磻�管放入實時熒光PCR儀樣品槽，做好標記。
 
3、第一階段,94C預變性5min；第二階段，94C變性30s，60C延伸30s，40個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸結束時進行熒光信號收集，熒光模式設為FAM/NONE雙標記模式。
 
四、結果判定
1、陰性對照的檢測結果應無特定的擴增曲線，且Ct值>32.0或無；陽性對照的Ct值應≤29.0，且出現(xiàn)特定的擴增曲線；如陰性對照和陽性對照結果不滿足以上條件，此次實驗視為無效。
2、Ct值≤29.0，而且出現(xiàn)特定的擴增曲線，則判定為副豬格拉瑟菌通用型陽性。
3、Ct值>32.0或無，并且無特定的擴增曲線，則判定為副豬格拉瑟菌通用型陰性。
4、29.0