1月22日，華中農業(yè)大學顏彥教授團隊聯合美國紀念斯隆-凱特琳癌癥中心Tuomas Tammela教授團隊，在國際知名期刊Nature發(fā)表題為“Critical role for a high-plasticity cell state in lung cancer”的重磅研究成果。

該研究通過一套高精度小鼠遺傳報告系統(tǒng)，首次證實并定位肺癌中一類具有“高可塑性細胞狀態(tài)（HPCS）”的特殊腫瘤細胞。它們連接并調控著不同細胞狀態(tài)之間的轉換，驅動肺癌進展、促進細胞多樣性并導致治療耐受。這項研究為理解癌癥可塑性的組織提供了新理論框架，也為開發(fā)靶向腫瘤細胞狀態(tài)轉換的新型治療策略奠定了基礎。

南模生物為該研究提供了Slc4a11-FSF-MCD，Hopx-FSF-MACD以及Hipp11-FSF-GGCB三個小鼠模型。

1 HPCS細胞的追蹤與耗竭工具鼠
肺腺癌（LUAD）是一種常見、難治且致死率高的實體腫瘤。KP小鼠模型通過在肺上皮細胞中特異性表達或利用病毒表達Cre重組酶，激活KrasG12D突變并失活p53，使小鼠自發(fā)肺腺癌。該模型能夠精準模擬人類LUAD的發(fā)生發(fā)展過程，重現其關鍵分子事件及組織病理特征。

研究者利用scRNA-seq構建KP小鼠肺腺癌演化圖譜，發(fā)現一種持續(xù)存在于腫瘤早期及全程的高可塑性細胞狀態(tài)（HPCS），這類細胞的轉錄組特征呈現同時啟動與多種細胞身份相關的基因程序的特點，并且在癌細胞的演化圖譜中腫瘤進展關鍵轉折點。

通過篩選，研究者發(fā)現Slc4a11是KP LUAD模型中HPCS細胞的特異性標志物（圖1a）。借此標志物，研究者構建了一整套報告系統(tǒng)，用于對HPCS細胞進行可視化、分離、譜系示蹤和耗竭。

首先，研究者將帶有frt-Stop-frt位點、mScarlet紅色熒光蛋白、他莫昔芬誘導型Cre重組酶（creERT2）及人白喉毒素受體（DTR）的MCD報告盒敲入Slc4a11基因之后，構建了Slc4a11-FSF-MCD小鼠。

其次，研究者進一步構建了Hipp11-FSF-GGCB小鼠。Hipp11基因是小鼠的普遍表達位點，研究者在Hipp11后連接了frt-Stop-frt位點、海腎熒光素酶（G-Luc）與eGFP融合報告基因（簡稱GG），海樽熒光素酶（C-Luc）與TagBFP融合報告基因（簡稱CB），并且GC序列兩端存在loxp位點，可受到Cre重組酶的調控（圖1c）。

研究者將Slc4a11-FSF-MCD、Hipp11-FSF-GGCB與KPfrt小鼠進行交配，獲得KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠，并使用氣管滴注Flp病毒誘導KP小鼠肺腺癌形成（圖1c,d）。肺癌組織被eGFP標記，Slc4a11陽性的HPCS細胞被mScarlet標記。在腫瘤誘導后15-16周，原位肺腫瘤中mScarlet陽性細胞占eGFP陽性癌細胞總數的平均比例為17.0±4.3%，這一比例與單細胞RNA測序檢測到的HPCS細胞比例（13.1±1.6%）高度吻合。組織切片空間分析顯示，mScarlet陽性細胞在腫瘤組織中呈小簇狀或單細胞狀分布（圖1f）。mScarlet陽性細胞在腫瘤組織中與另一HPCS細胞的標志物integrin α2的表達也接近一致（圖1e，g），由此可得，Slc4a11^MCD/+可作為HPCS細胞特異性報告系統(tǒng)。
 

Fig1. The Slc4a11^MCD/+ reporter system marks the HPCS in vivo.

2 HPCS 是細胞狀態(tài)轉換的樞紐
肺癌進展的核心特征之一是肺上皮細胞身份的喪失，表現為肺上皮關鍵調控因子NKX2.1的下調與胚胎期轉錄調控因子Hmga2的表達。而研究者發(fā)現，隨著病程加劇，KPfrt;Slc4a11^MCD/+小鼠的肺癌組織中HPCS的密度升高（圖1h），并且 HPCS中的NKX2.1表達減少，HMGA2表達增加。隨著相關證據提出，研究者懷疑HPCS可能在早期腫瘤病變中的肺泡狀態(tài)與肺癌進展后期出現的細胞狀態(tài)之間起著關鍵的過渡作用。

為探究HPCS在腫瘤微環(huán)境中的轉換潛能，研究者進一步開發(fā)了一套針對HPCS細胞的譜系追蹤系統(tǒng)，將KPfrt;Slc4a11^MCD/+小鼠與報告基因工具鼠Rosa26^mTmG/+小鼠交配。該小鼠的全身細胞可表達 tdTomato熒光蛋白，而當使用TAM誘導Cre活性后，在TAM代謝期（給藥后三天）的HPCS細胞將表達GFP 熒光蛋白。這部分GFP陽性細胞將被認為是示蹤細胞。

在給藥14天后，對早期（6周）和晚期（12周）腫瘤中分選出的示蹤細胞（GFP陽性）進行scRNA-seq分析顯示，仍處于HPCS狀態(tài)（mScarlet陽性）的示蹤細胞比例相較于第3天基線水平急劇下降，表明大多數被示蹤細胞在14天內已不再是HPCS并獲得了新的細胞命運（圖2c–f）。衡量細胞群體內細胞表型多樣性的定量指標——表型體積同樣說明了這一問題（圖2g–h）。

為了對比HPCS與AT1樣細胞的可塑性，研究者也在AT1細胞標志物Hopx基因后敲入了FSF-mScarlet-AkaLuc-CreER-DTR（簡稱FSF-MACD），并構建了KPfrt;Hopx^MACD/+;Rosa26^mTmG/+小鼠。經過與上述一致的TAM誘導示蹤后，針對示蹤的AT1樣細胞進行scRNA-seq分析顯示。結果表明，在晚期（12周）腫瘤中分選出的示蹤AT1樣細胞內始終維持在AT1樣狀態(tài)，且被示蹤細胞的表型體積實際上發(fā)生了收縮（圖2i–k）。這說明僅有HPCS具有高度可塑性，而且會由HPCS產生具有固定表型和低可塑性的癌細胞狀態(tài)，例如AT1樣狀態(tài)。
 

Fig2. The HPCS is a hub for cell state transitions in vivo.

3 非HPCS細胞可轉化為HPCS狀態(tài)
在KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Rosa26^mTmG/+小鼠的示蹤實驗中，研究者發(fā)現一個獨特的現象：被示蹤的HPCS細胞（GFP陽性）會快速退出HPCS狀態(tài)，而腫瘤中HPCS細胞（mScarlet陽性）的相對比例卻保持穩(wěn)定。這表明，非HPCS細胞可能具有獲得HPCS狀態(tài)的能力。

為此，研究者將KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠中的原代非HPCS細胞（mScarlet⁻GFP⁺細胞）接種到普通小鼠的肺部；同時以純化的HPCS細胞（mScarlet⁺GFP⁺）作為對照進行移植。值得注意的是，由非HPCS細胞群體產生的腫瘤中，mScarlet陽性細胞的比例與原親本腫瘤相似（圖2l,m），表明非HPCS細胞能夠獲得HPCS狀態(tài)。

綜上所述，這些數據表明，HPCS并非一種只能通過預先存在的HPCS細胞自我更新產生的干細胞樣狀態(tài)，而是能夠在非HPCS狀態(tài)之間動態(tài)互變。

4 HPCS 會促進腫瘤的生長和進展
為了探究HPCS在腫瘤微環(huán)境中的生長潛能，研究者構建了標記HPCS細胞的KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+ 小鼠；隨機標記部分癌細胞的KPfrt;Rosa26^{FSF-CreERT2/+};Hipp11^GGCB/+小鼠；標記AT1樣細胞的KPfrt;Hopx^MACD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠。這三類小鼠的Hipp11^GGCB/+報告基因在正常情況下表達G-Luc與eGFP融合報告基因（簡稱GG），而當使用TAM誘導Cre活性后會表達C-Luc與TagBFP融合報告基因（簡稱CB）（圖3a,b）。在腫瘤誘導后14-16周的已建立LUAD中，通過C-Luc/G-Luc進行縱向譜系示蹤發(fā)現，源自HPCS的癌細胞相較于隨機標記的癌細胞具有顯著更高的生長潛能和克隆擴增能力，而分化型AT1樣細胞的生長潛能較低（圖3c）。

盡管HPCS具有高生長潛能，但研究者發(fā)現HPCS本身高度靜息。在KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Rosa26^mTmG/+小鼠中，由HPCS分化而來并退出HPCS狀態(tài)的LUAD細胞在示蹤后第3天就顯示出高增殖能力，并在第14天進一步升高，而非HPCS衍生物的增殖率保持恒定（圖3e）。這些數據表明，雖然HPCS整體處于靜息狀態(tài)，但其部分衍生物在退出HPCS后迅速進入細胞周期，驅動HPCS來源的癌細胞發(fā)生克隆擴增，并推動腫瘤生長。

由于HPCS在腫瘤發(fā)生早期出現并產生進展期細胞狀態(tài)，研究者認為其在早期腫瘤進展中起著關鍵作用。因此，研究者在腫瘤誘導后第1周開始至第7周，通過連續(xù)全身性給予白喉毒素（DT），將KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠中的HPCS進行細胞剃除。結果表明，DT組的總腫瘤負荷顯著降低，未出現大尺寸（>0.15 mm²）的腫瘤病變（圖3h）。HPCS的細胞剃除抑制了具有高增殖率或表達HNF4^α的兼具肺和胃樣特征的混合細胞狀態(tài)的出現（圖3i-j），這些結果表明，HPCS對于增生性病變的起始并非必需，但對于這些腫瘤的進展至關重要。

研究者進一步在體外構建了KP;Slc4a11^MACD/+LUAD細胞系，并將其接種至NSG小鼠上，與原發(fā)腫瘤中的情況一致，在該模型的皮下同種移植瘤中HPCS的耗竭產生了顯著的抗腫瘤效應（圖3m）。綜上所述，這些結果表明HPCS對于早期肺腫瘤的進展至關重要。
 

Fig3. The HPCS drives tumour growth.

5 耐藥性起源于HPCS
研究者繼續(xù)在KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠中進行兩種給藥測試（順鉑化療與靶向KRAS(G12D)的MRTX1133），探究HPCS是否產生治療抵抗狀態(tài)的細胞類型（圖4a）。結果發(fā)現，治療反應主要清除非HPCS來源的細胞，而HPCS來源的細胞顯著富集（圖4b）。

研究者進一步分析了治療3周后KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠腫瘤中被示蹤的HPCS來源細胞的命運。兩種治療手段都降低了被示蹤細胞的表型體積（圖4c），表明治療引導HPCS向更少的狀態(tài)分化。兩種治療均降低了被示蹤細胞池和總細胞池中仍處于HPCS狀態(tài)的細胞比例（圖4d），表明HPCS本身并不耐藥，但它產生了由耐藥狀態(tài)組成的微小殘留病灶MRD。將DT介導的HPCS消融與順鉑或MRTX1133聯合使用，實現了近乎完全的腫瘤根除（圖4e-g）。

同時，研究者發(fā)現Plaur（編碼uPAR）在HPCS中顯著富集。研究者在接腫了KP;Slc4a11^MACD/+LUAD細胞系的皮下同種移植瘤模型中測試了靶向uPAR的CAR T療法，產生了強烈的抗腫瘤反應，表現為Slc4a11-AkaLuc信號消失和腫瘤生長延緩（圖4i–k）。

綜上所述，這些發(fā)現表明HPCS是一種關鍵的、可靶向治療的癌細胞狀態(tài)，驅動著腫瘤進展、異質性和治療抵抗。

Fig4. Drug-resistant cell states originate from the HPCS.

6 HPCS在多種癌種與其他多種組織的再生上皮中反復出現
鑒于HPCS在LUAD中的關鍵作用，研究者推測HPCS可能反映了多種癌癥中共有的關鍵癌細胞狀態(tài)。研究者在結直腸癌、頭頸癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺導管腺癌、前列腺腺癌和皮膚鱗狀細胞癌的單細胞數據集中均確認了HPCS特征的存在（圖5a）。在人類LUAD組織中，SLC4A11、PLAUR、HPCS特征與應激程序同樣相關（圖5b）。而這一相關性同樣出現在小鼠的肺損傷后肺泡、胰腺、腸道和皮膚的損傷相關再生上皮中（圖5c-d），這一發(fā)現提示腫瘤可能通過“劫持”機體固有的再生與修復程序，獲得持續(xù)進行細胞狀態(tài)轉換的能力，從而在治療壓力下不斷“進化升級”，獲得長期生存優(yōu)勢。
 

Fig5. An HPCS-like state marked by Slc4a11 and Plaur is ubiquitously present in multiple carcinomas and regenerating epithelia.

這項研究將腫瘤異質性與細胞可塑性的理論假設，從概念推向了實驗驗證，并鎖定為一個可干預的靶點。它提示我們，未來的抗癌策略或許不僅要殲滅腫瘤的“主力部隊”，更需精準識別并清除那些驅動演化與耐藥的核心“變形軍團”。靶向HPCS有望成為與現有療法協同作戰(zhàn)的“組合拳”，通過提前鏟除耐藥種子，最大化化療與靶向治療的持久性和徹底性，甚至為高危人群的癌癥預防提供新思路。

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