方案摘要： 本方案使用了Pipetty電動(dòng)移液器的核心優(yōu)勢(shì)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作流程，包括核酸提取、RT-PCR反應(yīng)體系配制、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)等關(guān)鍵步驟。相較于傳統(tǒng)手動(dòng)移液器，Pipetty電動(dòng)移液器具備突出的連續(xù)分液優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)單次吸液、多次精準(zhǔn)分液，有效避免手動(dòng)反復(fù)吸液導(dǎo)致的體積誤差，同時(shí)降低長(zhǎng)時(shí)間操作帶來的手部疲勞，大幅提升移液效率；其精準(zhǔn)的體積控制能力，能有效規(guī)避手動(dòng)移液器因人為按壓力度不均、操作手法差異造成的移液偏差，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和檢測(cè)準(zhǔn)確性，為豬水皰病的快速、精準(zhǔn)診斷提供標(biāo)準(zhǔn)化操作依據(jù)。
 
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
豬水皰�。⊿VD）是由豬水皰病病毒（SVDV）引起的一種急性、接觸性傳染病，其病毒核酸為單股正鏈RNA。熒光RT-PCR技術(shù)結(jié)合了反轉(zhuǎn)錄（RT）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的優(yōu)勢(shì)，首先通過反轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），再以cDNA為模板，利用特異性引物和熒光探針，在Taq酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增過程中，熒光探針被酶切降解，釋放出熒光信號(hào)，熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過循環(huán)閾值（Ct值）判斷樣本中是否含有SVDV核酸及核酸含量。Pipetty電動(dòng)移液器通過精準(zhǔn)控制移液體積，確保反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增體系中各試劑比例準(zhǔn)確，減少人為誤差，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 熒光定量PCR儀；
③ 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；
④ 無核酸酶的離心管與吸頭；
⑤ 熒光PCR擴(kuò)增管或熒光PCR反應(yīng)板。
 
2、試劑和材料
① 上游引I物:5'-GGCAACGCATACAGCATGTT-3'.
   下游引I物:5'-GCCGTATGTCCCTTGCTTGT-3'0
探針:5'-FAM-TATGACGGGTGGGCCAGGTT-BHQ1-3'。
       ② 熒光RT-PCR反應(yīng)試劑:一步法熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液、酶混合液(含反轉(zhuǎn)錄酶、Tag酶和RNase抑制劑等)。
③ 總RNA提取試劑。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、選用酚-氯仿法、RNA提取試劑盒、自動(dòng)化核酸提取儀等方式進(jìn)行核酸提取。采用酚-氯仿法提取核酸按下列步驟:
a)用Pipetty電動(dòng)移液器取待檢樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各300μL，分別置于1.5mL無核酸酶離心管中，每管加入300μL變性液異硫氰酸胍或Trizol試劑，反復(fù)輕輕混勻，冰浴5min；
b)每管加入60μL 2mol/L乙酸鈉（pH4.0），輕輕混勻；
 
C）每管加入800μL苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻，冰浴5min；
D）8000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈離心管;
e)加800μL異丙醇，混勻，室溫放置15min;
f) 4℃，12000 r/min，離心10 min,倒掉上清液，盡量倒干液體，留下RNA沉淀;
g)加1000μL75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇顛倒洗滌沉淀，4℃，10 000r/min,離心5min。倒干液體,室溫干燥5 min~10 min;
h)使用Pipetty連續(xù)分液模式，每管加10μL無核酸酶水，用于溶解RNA。總RNA提取液可立即用于RT-PCR擴(kuò)增，也可置于-70℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br /> 2、為每個(gè)樣品準(zhǔn)備熒光RT-PCR混合物，推薦為待檢的批量樣品整批準(zhǔn)備擴(kuò)增預(yù)混合體系為宜，并按照樣本數(shù)n+2+1準(zhǔn)備反應(yīng)體系。
熒光RT-PCR檢測(cè)擴(kuò)增預(yù)混合體系為:
----------12.5μL 2×一步法熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液;
----------1μL酶混合液;
----------0.5μL上游引物10 μmol/L;
----------0.5μL下游引物10 μmol/L;
----------0.5μL探針10 μmol/L;
----------7μL無核酸酶水。
 
3、根據(jù)計(jì)算的總體系量，用Pipetty電動(dòng)移液器依次吸取各試劑，加入同一潔凈無核酸酶離心管中，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。使用Pipetty的連續(xù)分液模式，將配制好的預(yù)混合體系按22μL/管的量，分裝入熒光PCR擴(kuò)增管中；
4、在已分裝有預(yù)混合體系的PCR擴(kuò)增管中，分別加入3μL已提取的總RNA，蓋緊管蓋，輕輕顛倒混勻。放入臺(tái)式離心機(jī)中，短暫離心。
 
5、將PCR擴(kuò)增管放入熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增：42℃ 30min，94℃ 3min，然后94℃ 20s、60℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。
6、試驗(yàn)成立條件
陰性對(duì)照無Ct值,并且無擴(kuò)增曲線;陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)≤25,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。
 
四、結(jié)果判定
1、Ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判定樣品為SVDV核酸陽性。
2、無Ct值，且無擴(kuò)增曲線，則判為SVDV核酸陰性。
3、當(dāng)35＜Ct值＜38，且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線的樣本應(yīng)重新檢測(cè)，重新檢測(cè)結(jié)果無特異性擴(kuò)增曲線或無Ct 值或者Ct 值＞38為SVDV核酸陰性。Ct值≤38且有特異性擴(kuò)增曲線則判為SVDV核酸陽性。