qPCR實(shí)驗(yàn)無(wú)Ct值出現(xiàn)的常見(jiàn)誘因總結(jié)
熒光定量PCR試劑盒出現(xiàn)無(wú)Ct值的主要原因包括：PCR循環(huán)數(shù)不足、熒光信號(hào)采集步驟錯(cuò)誤、引物或探針降解、模板量不足或降解、引物設(shè)計(jì)不當(dāng)以及反應(yīng)體系設(shè)置問(wèn)題。
具體可從以下幾個(gè)方面排查：
1、循環(huán)數(shù)不夠
一般建議設(shè)置35–45個(gè)循環(huán)，低于35可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量不足，無(wú)法達(dá)到檢測(cè)閾值；但超過(guò)45會(huì)增加背景噪聲，影響定量準(zhǔn)確性。
2、熒光信號(hào)采集時(shí)機(jī)錯(cuò)誤
不同檢測(cè)方法對(duì)信號(hào)采集時(shí)間有特定要求：
SYBR Green法（SG法）通常在72℃延伸時(shí)采集信號(hào)；
TaqMan探針?lè)▌t多在退火結(jié)束或延伸階段采集。
若程序未正確設(shè)置采集步驟，或未勾選熒光檢測(cè)選項(xiàng)，則無(wú)法獲取信號(hào)。
3、引物或探針降解或設(shè)計(jì)缺陷
降解可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)，若條帶彌散或模糊，需重新合成。
設(shè)計(jì)不合理如Tm值差異過(guò)大（上下游引物>4℃）、GC含量過(guò)高、3'端互補(bǔ)易形成二聚體等，均會(huì)影響擴(kuò)增效率。
4、模板相關(guān)問(wèn)題
模板量不足：尤其對(duì)低拷貝樣本，建議從系列稀釋的最高濃度開(kāi)始測(cè)試。
模板降解：避免反復(fù)凍融和雜質(zhì)污染，建議分裝保存。
5、反應(yīng)條件與試劑問(wèn)題
Mg2+濃度不適宜會(huì)影響Taq酶活性，應(yīng)依據(jù)試劑盒說(shuō)明優(yōu)化。
試劑污染、加樣誤差或未添加ROX校正染料（在需要的儀器中）也可能導(dǎo)致無(wú)信號(hào)。
6、軟件分析參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤
即使有擴(kuò)增曲線，若閾值線（threshold）設(shè)置不當(dāng)，或未正確選擇參與分析的孔位，系統(tǒng)也可能顯示“Undetermined”。
具體可從以下幾個(gè)方面排查：
1、循環(huán)數(shù)不夠
一般建議設(shè)置35–45個(gè)循環(huán)，低于35可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量不足，無(wú)法達(dá)到檢測(cè)閾值；但超過(guò)45會(huì)增加背景噪聲，影響定量準(zhǔn)確性。
2、熒光信號(hào)采集時(shí)機(jī)錯(cuò)誤
不同檢測(cè)方法對(duì)信號(hào)采集時(shí)間有特定要求：
SYBR Green法（SG法）通常在72℃延伸時(shí)采集信號(hào)；
TaqMan探針?lè)▌t多在退火結(jié)束或延伸階段采集。
若程序未正確設(shè)置采集步驟，或未勾選熒光檢測(cè)選項(xiàng)，則無(wú)法獲取信號(hào)。
3、引物或探針降解或設(shè)計(jì)缺陷
降解可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)，若條帶彌散或模糊，需重新合成。
設(shè)計(jì)不合理如Tm值差異過(guò)大（上下游引物>4℃）、GC含量過(guò)高、3'端互補(bǔ)易形成二聚體等，均會(huì)影響擴(kuò)增效率。
4、模板相關(guān)問(wèn)題
模板量不足：尤其對(duì)低拷貝樣本，建議從系列稀釋的最高濃度開(kāi)始測(cè)試。
模板降解：避免反復(fù)凍融和雜質(zhì)污染，建議分裝保存。
5、反應(yīng)條件與試劑問(wèn)題
Mg2+濃度不適宜會(huì)影響Taq酶活性，應(yīng)依據(jù)試劑盒說(shuō)明優(yōu)化。
試劑污染、加樣誤差或未添加ROX校正染料（在需要的儀器中）也可能導(dǎo)致無(wú)信號(hào)。
6、軟件分析參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤
即使有擴(kuò)增曲線，若閾值線（threshold）設(shè)置不當(dāng)，或未正確選擇參與分析的孔位，系統(tǒng)也可能顯示“Undetermined”。
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