PCR擴(kuò)增目的基因，膠圖總是一片空白？反復(fù)摸索退火溫度，膠圖全是雜帶？同學(xué)，你需要換一對(duì)引物了，一份包教包會(huì)的克隆引物設(shè)計(jì)指南送給你。

引物設(shè)計(jì)的一般原則
設(shè)計(jì)引物需要遵循的原則較多，如引物要有特異性，GC含量在40%-60%之間，Tm值在55-65℃，一對(duì)引物Tm值與GC含量不能相差太多，長(zhǎng)度在16~30 bp為宜，避免一對(duì)引物發(fā)生互補(bǔ)，3′端不能選擇A，堿基要隨機(jī)分布等。

基因克隆引物通常由酶切識(shí)別序列和與靶基因互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列兩部分組成，特異性序列的靶點(diǎn)在基因CDS序列的兩端，是相對(duì)固定的。因此克隆引物中的可變序列較少，需在盡量不改變特異性序列的條件下，通過(guò)修改酶切識(shí)別序列優(yōu)化引物對(duì)。

兩步學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)克隆引物
1.明確載體多克隆位點(diǎn)處限制酶的種類(lèi)，并下載目的基因CDS序列。
基因克隆中使用引物一是為了將基因CDS序列從cDNA中大量擴(kuò)增，便于后續(xù)膠回收利用，二是通過(guò)酶切將基因連入載體中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此需在CDS序列中篩選多克隆位點(diǎn)處所有限制酶的識(shí)別序列，選擇載體多克隆位點(diǎn)的限制酶時(shí)，應(yīng)避開(kāi)在CDS內(nèi)部存在識(shí)別序列的限制酶，否則會(huì)導(dǎo)致CDS序列被酶切，進(jìn)而連入載體的序列不完整。

若CDS序列內(nèi)含有多克隆位點(diǎn)處所有限制酶識(shí)別序列，則考慮更換載體，若無(wú)法更換載體則可通過(guò)優(yōu)化不完全酶切時(shí)間，獲得酶切的CDS全長(zhǎng)序列，或采用無(wú)縫克隆試劑盒，跳過(guò)酶切步驟。

2. 通過(guò)修改酶切識(shí)別序列優(yōu)化引物對(duì)。
將所有可用的酶切識(shí)別序列分別連接至引物對(duì)5’端，可獲得多對(duì)引物，利用生信軟件分析不同引物對(duì)的GC含量，TM值，序列特異性等信息，獲得評(píng)分較高的引物對(duì)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

若評(píng)分較高的引物對(duì)還是存在GC含量、TM值相差過(guò)大，特異性不好等問(wèn)題，可以通過(guò)在酶切識(shí)別序列兩端添加1-3bp保護(hù)序列，逐步調(diào)整和優(yōu)化引物對(duì)。