該研究由Zhaoqiang Wang, Ruixuan Zhao, Daniel A Wagenaar, Diego Espino, Liron Sheintuch, Ohr Benshlomo, Wenjun Kang, Calvin K. Lee, William C. Schmidt, Aryan Pammar, Enbo Zhu, Jing Wang, Gerard C.L. Wong, Rongguang Liang, Peyman Golshani, Tzung K. Hsiai, Liang Gao等合作完成，研究成果于2025年發(fā)表在期刊《nature methods》，文章標(biāo)題為“Kilohertz volumetric imaging of in vivo dynamics using squeezed light field microscopy”。

重要發(fā)現(xiàn)
01技術(shù)原理與光學(xué)設(shè)計(jì)
SLIM的核心思想是通過光學(xué)的“壓縮”與“旋轉(zhuǎn)”編碼，將傳統(tǒng)光場(chǎng)顯微鏡（LFM）所需采集的四維光場(chǎng)信息（二維空間+二維角度）高效地壓縮到二維相機(jī)傳感器的一個(gè)狹長矩形區(qū)域（ROI）內(nèi)。其光學(xué)系統(tǒng)關(guān)鍵包含一個(gè)多視角旋轉(zhuǎn)模塊和一個(gè)各向異性中繼系統(tǒng)。多視角旋轉(zhuǎn)模塊由一系列不同角度的鴿翼棱鏡（Dove Prism）和透鏡陣列（Lenslet Array）組成，每個(gè)棱鏡-透鏡對(duì)產(chǎn)生一個(gè)特定旋轉(zhuǎn)角度的子孔徑圖像。各向異性中繼系統(tǒng)則使用兩個(gè)正交的柱面雙合透鏡，對(duì)圖像陣列進(jìn)行異向縮放，在一個(gè)方向上（通常為垂直方向）進(jìn)行0.2倍的 demagnification（“擠壓”），而在另一方向（水平方向）保持原放大倍率。

這種設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)在于充分利用了現(xiàn)代CMOS傳感器的特性。傳感器的幀率僅與需要讀出的像素行數(shù)成反比，而與列數(shù)無關(guān)。通過僅讀取接收光信號(hào)的像素行（一個(gè)窄條狀ROI），SLIM實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)高于全幀模式的讀出速度。例如，使用200x3200像素的ROI，SLIM能以1326 fps（16位）或7476 fps（8位）的速度記錄19個(gè)子孔徑圖像，而全幀模式僅能提供83 fps或500 fps。

在計(jì)算重建方面，SLIM基于傅里葉切片定理和迭代反卷積算法（Richardson-Lucy）。每個(gè)經(jīng)過擠壓和旋轉(zhuǎn)的子孔徑圖像，在三維傅里葉頻譜中表現(xiàn)為一個(gè)橢圓形的切片。通過融合一系列具有互補(bǔ)旋轉(zhuǎn)角度的子孔徑圖像，可以填補(bǔ)缺失的高頻信息，合成出接近原始未壓縮光場(chǎng)顯微鏡帶寬的功率譜，從而高保真地重建出三維熒光分布。

02實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與成像性能
研究團(tuán)隊(duì)搭建了兩套SLIM系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證：一套采用寬場(chǎng)落射式照明，用于通過顱窗對(duì)小鼠進(jìn)行成像；另一套采用選擇性體積側(cè)面照明（如掃描光片或狹縫限制的LED照明），用于斑馬魚幼蟲和解剖的水蛭神經(jīng)節(jié)等小樣本，以抑制成像體積外的熒光，特別是在散射組織中。

通過對(duì)亞衍射尺寸熒光珠的成像，團(tuán)隊(duì)量化了SLIM的成像性能。在3.6倍的放大倍率下，其成像體積可達(dá)直徑550微米 x 深度300微米，空間分辨率達(dá)到橫向3.6微米，軸向6.0微米。SLIM每秒能夠記錄和重建高達(dá)73億個(gè)有效體素（7.3 Gigavoxels per second），使其成為文獻(xiàn)中最快的3D熒光顯微鏡之一。

在血流動(dòng)力學(xué)應(yīng)用中，SLIM以1000 vps的速率對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎（紅細(xì)胞表達(dá)DsRed）的大腦進(jìn)行成像。重建結(jié)果揭示了紅細(xì)胞的三維分布，并允許進(jìn)行細(xì)胞追蹤，從而量化了主動(dòng)脈和靜脈中脈沖式、空間變化的血流速度，最高可達(dá)6 mm/s。其千赫茲成像速度有效消除了運(yùn)動(dòng)模糊，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)健的細(xì)胞追蹤。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步展示了其對(duì)自由擺動(dòng)（無需鎮(zhèn)靜）斑馬魚尾部的高頻擺動(dòng)成像，清晰捕捉了紅細(xì)胞在血管中的復(fù)合運(yùn)動(dòng)。

在神經(jīng)電生理應(yīng)用中，SLIM的能力得到了極致發(fā)揮。電壓成像因其信號(hào)微弱（ΔF/F低）、瞬變極快（毫秒級(jí)），對(duì)成像系統(tǒng)的時(shí)間和靈敏度要求極高。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)加載了電壓敏感染料（FluoVolt）的藥用水蛭神經(jīng)節(jié)進(jìn)行成像，同時(shí)使用細(xì)胞內(nèi)微電極進(jìn)行電生理刺激和記錄作為金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

SLIM以800 vps的速率采集29個(gè)子孔徑圖像，成功重建出的三維圖像序列足以精確采樣神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏臅r(shí)序和波形。光學(xué)測(cè)量結(jié)果與電生理記錄在定量細(xì)節(jié)上高度一致，包括施加強(qiáng)去極化電流時(shí) spike 幅度的降低。在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，團(tuán)隊(duì)刺激水蛭神經(jīng)節(jié)誘發(fā)“虛擬游泳”節(jié)律，SLIM清晰地記錄到了不同運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（DI-1, DE-3, VE-4等）中與游泳節(jié)律（1-1.5 Hz）特征一致的節(jié)律性活動(dòng)，并通過相干性分析量化了各神經(jīng)元參與節(jié)律生成的幅度和相位，其結(jié)果與預(yù)測(cè)模型高度吻合。

最引人注目的演示是在行為小鼠的海馬體中進(jìn)行電壓成像。研究通過在CA1區(qū)表達(dá)基因編碼電壓指示劑（GEVI）pAce的小鼠顱窗，以800 Hz的體積速率連續(xù)成像三分鐘，同時(shí)使用光學(xué)旋轉(zhuǎn)編碼器記錄小鼠在跑步機(jī)上的運(yùn)動(dòng)。

SLIM提供了跨越大型體積的神經(jīng)元群體電壓信號(hào)的三維映射，允許從不同深度的神經(jīng)元同時(shí)進(jìn)行光學(xué)測(cè)量。從提取的膜電位軌跡中，不僅檢測(cè)到了強(qiáng)烈的、與運(yùn)動(dòng)速度相關(guān)的動(dòng)作電位調(diào)制，還觀察到了海馬體中常見的4-10 Hz頻段的細(xì)微閾下膜電位振蕩（ likely theta振蕩）。信號(hào)保真度通過無活性神經(jīng)元和背景區(qū)域缺乏此類活動(dòng)得到進(jìn)一步證實(shí)。大多數(shù)神經(jīng)元的放電頻率與運(yùn)動(dòng)速度呈正相關(guān)，這與先前發(fā)現(xiàn)一致。

03結(jié)合掃描照明提升分辨能力
盡管SLIM等光場(chǎng)技術(shù)具有數(shù)值重聚焦的能力，但通常缺乏內(nèi)在的光學(xué)切片能力，對(duì)高密度標(biāo)記的物體成像存在挑戰(zhàn)。團(tuán)隊(duì)演示了將SLIM與掃描多平面光片照明相結(jié)合的策略。通過掃描光片并使用相機(jī)在每次掃描中捕獲多個(gè)幀，每個(gè)幀對(duì)應(yīng)不同的深度層，顯著抑制了離焦光，提高了重建的軸向分辨率和對(duì)比度。

團(tuán)隊(duì)以300 vps的速率對(duì)跳動(dòng)斑馬魚心臟（心肌表達(dá)GFP）進(jìn)行成像。通過以300 Hz掃描雙光片，并與相機(jī)以4800 fps（8位速度模式）記錄同步，成功重建了跨越200微米深度范圍的30個(gè)平面的心臟結(jié)構(gòu)，心室小梁等微結(jié)構(gòu)清晰可辨。增強(qiáng)的空間分辨率和對(duì)比度為心臟腔室?guī)缀涡螤畹臏?zhǔn)確分割提供了可能，可用于區(qū)域心肌收縮力分析和血流動(dòng)力學(xué)模擬。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
SLIM技術(shù)的核心創(chuàng)新在于它成功突破了高速三維熒光顯微成像中固有的硬件帶寬與有限光子預(yù)算之間的瓶頸難題。其技術(shù)創(chuàng)新體現(xiàn)在三個(gè)方面：

首先，它提出了一種全新的光學(xué)壓縮編碼策略。通過鴿翼棱鏡陣列實(shí)現(xiàn)多角度旋轉(zhuǎn)視圖，再結(jié)合各向異性的中繼系統(tǒng)進(jìn)行單向圖像“擠壓”，SLIM巧妙地將傳統(tǒng)上需要大面積傳感器才能記錄的四維光場(chǎng)信息，“壓縮”到一個(gè)低格式的狹長傳感器ROI內(nèi)。這種設(shè)計(jì)是壓縮傳感思想在光學(xué)硬件上的巧妙實(shí)現(xiàn)，它基于光場(chǎng)固有的空-角相關(guān)性，從壓縮測(cè)量中恢復(fù)信號(hào)，是區(qū)別于現(xiàn)有編碼掩模、隨機(jī)擴(kuò)散片等壓縮光場(chǎng)成像技術(shù)的根本性突破。

其次，SLIM實(shí)現(xiàn)了前所未有的超高時(shí)空分辨率乘積。其數(shù)據(jù)效率極高，每秒能產(chǎn)生高達(dá)73億體素的有效信息量（7.3 Gigavoxels per second），在550x550x300 μm³的視野內(nèi)，以千赫茲的速率（最高可達(dá)1326 vps）進(jìn)行三維成像，同時(shí)保持微米級(jí)的分辨率。這將三維成像速度提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)，使其能夠捕捉毫秒級(jí)的瞬態(tài)生物過程，如神經(jīng)動(dòng)作電位和快速血流。

第三，SLIM展現(xiàn)了卓越的系統(tǒng)兼容性和實(shí)用性。它無需昂貴且通常性能有所妥協(xié)的超高速相機(jī)，而是通過優(yōu)化光學(xué)設(shè)計(jì)，將普遍使用的科學(xué)級(jí)CMOS相機(jī)轉(zhuǎn)化為千赫茲三維成像工具。其壓縮測(cè)量大幅降低了數(shù)據(jù)讀取和存儲(chǔ)的帶寬需求，使得長時(shí)間（如數(shù)分鐘）連續(xù)記錄大規(guī)模三維數(shù)據(jù)變得可行，這對(duì)于行為動(dòng)物研究至關(guān)重要。同時(shí)，SLIM的設(shè)計(jì)可以改造現(xiàn)有的傅里葉光場(chǎng)顯微鏡，顯著提升其成像速度。

總結(jié)與展望
SLIM（壓縮光場(chǎng)顯微鏡）作為一種創(chuàng)新的snapshot三維探測(cè)技術(shù)，成功解決了對(duì)千赫茲速度運(yùn)行的高速體積顯微鏡的迫切需求。它通過光學(xué)編碼和計(jì)算重建，巧妙地利用了光場(chǎng)的空-角關(guān)聯(lián)性和現(xiàn)代CMOS傳感器的特性，實(shí)現(xiàn)了在超大視野下的千赫茲三維成像，同時(shí)保持了微米級(jí)空間分辨率。該技術(shù)在活體血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)電壓成像和心臟功能研究等多個(gè)挑戰(zhàn)性應(yīng)用中得到了驗(yàn)證。

展望未來，SLIM技術(shù)仍有進(jìn)一步發(fā)展和優(yōu)化的空間。當(dāng)前重建算法依賴于樣本的稀疏性先驗(yàn)，在處理復(fù)雜密集信號(hào)時(shí)性能可能會(huì)下降。未來的工作可以集中于開發(fā)更先進(jìn)的重建算法，特別是嵌入物理模型的深度學(xué)習(xí)方法，以更好地解決SLIM中因有限空間帶寬和壓縮檢測(cè)帶來的病態(tài)逆問題，有望顯著提升其分辨能力和適用場(chǎng)景。此外，與多層掃描光片照明的結(jié)合展示了通過權(quán)衡成像速度來換取更好光學(xué)切片能力的可行性，這種思路可以擴(kuò)展到其他照明模式。隨著相機(jī)技術(shù)的不斷進(jìn)步，SLIM的成像速度有望進(jìn)一步提升至每秒數(shù)萬甚至數(shù)十萬體積，為探索生命科學(xué)中更快速的動(dòng)態(tài)過程打開新的大門�？傮w而言，SLIM為在大型體積內(nèi)跨層研究不同細(xì)胞類型之間的網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)和相互作用提供了一個(gè)強(qiáng)大而 accessible 的成像工具，具有巨大的應(yīng)用前景。

DOI:10.1101/2024.03.23.586416.