在一細胞中實現(xiàn)多基因共表達的方法策略
當細胞中需要表達多個基因時，可以選擇使用雙順反子或多順反子表達載體。在構建雙順反子或多順反子 載體的各種策略中，來源于腦心肌炎病毒 EMCV 的內(nèi)部核糖體進入位點 (internal ribosome entry site， IRES) 或來源于口蹄疫病毒 FMCV 的自剪切多肽 2A(self-cleaving 2A peptide，2A) 被廣泛應用，實現(xiàn)了 在單個載體上同時表達多個基因的目的。
◆內(nèi)部核糖體進入位點 IRES
IRES 能夠在一些反式作用因子的輔助下，招募核糖體小亞基到 mRNA 的翻譯起始位點，使蛋白質(zhì)翻譯起 始不依賴于 5′帽結(jié)構，從而使核糖體直接從 mRNA 中間起始翻譯成為可能，即允許在同一啟動子的控制 下共同表達多個基因。絕大多數(shù)細胞 IRES 元件位于起始密碼子上游的 5′ UTR 內(nèi)。然而，在有些情況下， IRES 位于起始密碼子的下游或位于編碼區(qū)，從而觸發(fā)截短蛋白的合成。攜帶有 IRES 元件的雙順反子或多 順反子 rAAV 載體可用于由同一啟動子控制的多個基因的共同表達。需要強調(diào)的是，IRES 下游基因的有效 表達依賴于特定的 IRES 序列，因此，保證 IRES 基因序列的完整性對于其高效活性至關重要。
IRES 的優(yōu)點：確保了 IRES 上下游基因的共表達；在 IRES 下游加入亞細胞定位等序列的可行性；
◆自剪切多肽 2A
自剪切多肽 2A 于 1991 年在口蹄疫病毒（FMDV）中被發(fā)現(xiàn)，平均長度為 18-22 個氨基酸，位于小 核糖核酸病毒家族成員的兩種蛋白質(zhì)之間。目前，主要有 4 種常用的 2A 肽，分別來源于口蹄疫病毒 2A(F2A)、1 型豬捷申病毒 2A (P2A)、明脈扁刺蛾病毒 2A (T2A)、馬甲型鼻炎病毒 2A (E2A)，序列如下：
F2A:VKQTLNFDLLKLAGCVESNPG
P2A:GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
T2A: EGRGSLLTCGDVEENPG
E2A:QCTNYALLKLAGDVESNPG
2A 肽的優(yōu)點：結(jié)構小，緩解了載體裝載量的壓力，也為聯(lián)合應用多種工具構建三個及以上順反子提供了 可能；上下游蛋白表達均衡；基于 2A 肽的雙順反子載體比基于 IRES 的載體更有效。
◆內(nèi)部核糖體進入位點 IRES
IRES 能夠在一些反式作用因子的輔助下，招募核糖體小亞基到 mRNA 的翻譯起始位點，使蛋白質(zhì)翻譯起 始不依賴于 5′帽結(jié)構，從而使核糖體直接從 mRNA 中間起始翻譯成為可能，即允許在同一啟動子的控制 下共同表達多個基因。絕大多數(shù)細胞 IRES 元件位于起始密碼子上游的 5′ UTR 內(nèi)。然而，在有些情況下， IRES 位于起始密碼子的下游或位于編碼區(qū)，從而觸發(fā)截短蛋白的合成。攜帶有 IRES 元件的雙順反子或多 順反子 rAAV 載體可用于由同一啟動子控制的多個基因的共同表達。需要強調(diào)的是，IRES 下游基因的有效 表達依賴于特定的 IRES 序列，因此，保證 IRES 基因序列的完整性對于其高效活性至關重要。
IRES 的優(yōu)點：確保了 IRES 上下游基因的共表達；在 IRES 下游加入亞細胞定位等序列的可行性；
◆自剪切多肽 2A
自剪切多肽 2A 于 1991 年在口蹄疫病毒（FMDV）中被發(fā)現(xiàn)，平均長度為 18-22 個氨基酸，位于小 核糖核酸病毒家族成員的兩種蛋白質(zhì)之間。目前，主要有 4 種常用的 2A 肽，分別來源于口蹄疫病毒 2A(F2A)、1 型豬捷申病毒 2A (P2A)、明脈扁刺蛾病毒 2A (T2A)、馬甲型鼻炎病毒 2A (E2A)，序列如下：
F2A:VKQTLNFDLLKLAGCVESNPG
P2A:GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
T2A: EGRGSLLTCGDVEENPG
E2A:QCTNYALLKLAGDVESNPG
2A 肽的優(yōu)點：結(jié)構小，緩解了載體裝載量的壓力，也為聯(lián)合應用多種工具構建三個及以上順反子提供了 可能；上下游蛋白表達均衡；基于 2A 肽的雙順反子載體比基于 IRES 的載體更有效。
Copyright(C) 1998-2026 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com