本文要點：近紅外二區(qū)（NIR-II）比率熒光成像在精準識別轉移性淋巴結（MLNs）方面具有巨大潛力，但其生物相容性探針設計仍面臨組成簡化與光譜可調性廣泛的挑戰(zhàn)。本研究開發(fā)了一種基于同源Ag₂Se量子點（QDs）的極簡自校準比率探針。通過合理設計三丁基膦介導的配位動力學，實現(xiàn)了935–1710 nm范圍內連續(xù)的尺寸依賴性發(fā)射調控，并系統(tǒng)闡明了合成機制與結構-性能的關系。低毒性的Ag₂Se核心結合聚（氨基酸）包覆，確保了優(yōu)異的生物安全性，經(jīng)體外細胞毒性與體內生化檢測驗證。兩種光譜差異顯著的量子點（發(fā)射峰分別為1040 nm和1305 nm，半高寬為176 nm和119 nm）可實現(xiàn)多路解剖成像，支持術中實時檢測與術后評估MLNs，診斷閾值比率約為0.9。本工作提出了一種可擴展的全NIR-II單色量子點合成策略，并建立了一種組分極簡的生物相容性平臺，用于精準比率診斷。

方案1. 調整Ag2Se量子點中的NIR-II覆蓋率，用于MLN的比率檢測

本研究通過用短鏈三丁基膦（TBP）替代傳統(tǒng)TOP，理性重構了Ag₂Se量子點（QDs）的合成體系，TBP具有更低的空間位阻和更強的Ag⁺配位能力，協(xié)同OT動態(tài)調控生長動力學。通過系統(tǒng)優(yōu)化反應溫度、TBP/Ag比例及Se/Ag化學計量比，闡明了反應的尺寸調控機制，實現(xiàn)了全NIR-II光譜覆蓋（935–1710 nm，方案1A）。隨后，選取了兩組光譜分離良好的Ag₂Se QDs，其發(fā)射峰分別位于1040 nm（S-QD，半高寬=176 nm）和1305 nm（L-QD，半高寬=119 nm），成功實現(xiàn)了血管-淋巴管、血管-胃腸道及單純淋巴結構的活體雙色成像。進一步將S-QD功能化修飾葉酸靶向基團，并與非靶向L-QD整合，構建了同源比率探針用于精準轉移性淋巴結（MLNs）檢測，其診斷閾值低于1（方案1B）。本研究為精準調控單波長發(fā)射Ag₂Se QDs提供了指導，建立了跨量子點體系的光譜調控框架，拓展了其在MLNs檢測中的生物醫(yī)學應用，推動了組分極簡、高安全性、高性能比率探針的發(fā)展。

圖1. 不同Ag2Se量子點發(fā)射的調控和表征

考慮Ag₂Se量子點的尺寸依賴特性，可通過調控其尺寸擴展發(fā)射范圍。在經(jīng)典合成方法中，通常通過控制反應溫度及Se-TOP復合物與乙酸銀的摩爾比來實現(xiàn)。然而，叔膦（PR₃，如TOP）的作用常被低估。近期研究表明，PR₃可與Ag⁺配位形成Ag-(PR₃)ₓ絡合物，其配位強度各不相同。因此，研究者推測，此前Ag₂Se量子點發(fā)射范圍窄、半高寬（FWHM）大的原因，可能源于Ag-TOP配位較弱，導致解離-成核動力學失衡，限制了顆粒成熟并影響其發(fā)光特性。采用更具反應活性的PR₃可改變合成動力學，獲得尺寸更大、FWHM更小的Ag₂Se量子點。基于三丁基膦（TBP）較短的烷基鏈，其因空間位阻減小和更強的σ-給電子能力，顯著增強了與Ag⁺的配位能力，通過多參數(shù)調控策略（涉及TBP含量、反應溫度及Se/Ag摩爾比）系統(tǒng)建立了Ag₂Se量子點的結構-性能關系（圖1a）。圖1b–g展示了在不同反應時間（1–80 min）及條件下獲得的Ag₂Se量子點的熒光光譜，以及其發(fā)射峰位置（圖1h–j）和FWHM的相應變化。

圖2. Ag₂Se量子點性質表征

為闡明結構-性能關系，選取發(fā)射波長分別為1030、1150、1300、1390、1520、1660和1710 nm的Ag₂Se量子點（QDs）進行系統(tǒng)表征（圖2a）。高分辨率透射電子顯微鏡圖像顯示，所有樣品的晶格間距均為0.24 nm，與正交相Ag₂Se的(013)晶面（JCPDS 24–1041）高度吻合，證實了晶體結構的均一性。統(tǒng)計分析表明，Ag₂Se量子點尺寸隨發(fā)射波長從2.53 nm增至6.2 nm（圖2b）。由于強電子限域效應，即使微小的尺寸變化也會導致顯著的發(fā)射波長偏移（≈700 nm）。此外，顆粒均勻性與光譜半高寬（FWHM）高度相關，驗證了此前觀察到的光學行為。吸收光譜顯示，隨著量子點尺寸增大，激子吸收峰持續(xù)紅移，表明帶隙減�。▓D2c）。值得注意的是，當尺寸接近≈7.2 nm（圖2d）時，NIR-II發(fā)射變得不可檢測，這歸因于帶隙收窄及帶內躍遷的出現(xiàn)。這些結果表明，Ag₂Se量子點在7 nm以下表現(xiàn)出顯著的量子限域效應，可實現(xiàn)全NIR-II波段的可調發(fā)射（圖2e）。通過Tauc圖計算的光學帶隙范圍為0.69至1.31 eV，并采用經(jīng)驗擬合公式（公式1）描述該NIR-II波段內尺寸依賴的光學特性（圖2f）：

結合上述合成策略與結構-性能關聯(lián)，研究者提出了一種改進的Ag₂Se量子點形成機制。如圖2g所示，實線與虛線分別代表Ag前驅體濃度與量子點尺寸的時序演化。綠色區(qū)域為Se-TBP前驅體注入前階段，隨后為快速成核階段（黃色）和生長階段（紅色）。盡管較高溫度與增大Se/Ag比均能加速成核與生長，但其作用機制略有不同：溫度主要通過調控前驅體反應性影響最終顆粒尺寸，而Se/Ag比則主要影響早期成核過程。在其他條件相同的情況下，增加TBP含量（如從0.8 mmol增至1.6 mmol）可使樣品呈現(xiàn)相似的初始生長速率，隨后進一步增大尺寸，這歸因于TBP對Ag₂Se的逐步溶解，提升了有效Ag濃度并促進后續(xù)生長。上述三個參數(shù)協(xié)同調控成核與成熟動力學。通過優(yōu)化這些因素，成功獲得了發(fā)射波長從935 nm至1710 nm可調的Ag₂Se量子點（圖2h）。進一步測量了絕對量子產(chǎn)率（PLQY），結果顯示其隨發(fā)射波長增加而逐漸降低，在1400 nm以上低于1%，這可能源于較大顆粒引入了更多表面缺陷。為實現(xiàn)比率檢測，需選用兩種光譜分離的量子點以供光譜儀與成像系統(tǒng)清晰區(qū)分。綜合考慮亮度，選取了中心發(fā)射波長分別約為1040 nm和1330 nm的兩種Ag₂Se量子點，其對應PLQY的局部最大值。如預期，僅通過切換光學濾光片（SP1150和LP1290）并采用單一808 nm連續(xù)激光激發(fā)，即可明確區(qū)分二者信號，為實際應用奠定了基礎。

圖3. S-QD和L-QD血管淋巴雙色成像

為實現(xiàn)活體成像，亟需具備高生物相容性的水分散型探針。聚（氨基酸）因其相較于聚醚酰亞胺、聚丙烯酸、聚乙二醇（PEG）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等傳統(tǒng)聚合物更優(yōu)異的生物相容性、可生物降解性及更低的免疫原性，近年來備受關注。然而，其在穩(wěn)定Ag₂Se量子點方面的應用仍屬空白。為此，本文合成了疏水性油胺接枝的聚琥珀酰亞胺（PSIOAm），其在堿性條件下水解可生成兩親性油胺接枝的聚天冬氨酸。利用該配體，兩種光譜可區(qū)分的Ag₂Se量子點成功轉移至水相，分別標記為S-QD（≈1040 nm，短波長量子點）和L-QD（≈1305 nm，長波長量子點）（圖3a）。動態(tài)光散射（DLS）測量顯示，S-QD和L-QD的流體動力學直徑分別為≈31 nm和≈48 nm，且二者ζ電位均接近−38 mV，表明其具有優(yōu)異的膠體穩(wěn)定性。S-QD和L-QD展現(xiàn)出卓越的光穩(wěn)定性：在808 nm連續(xù)激光照射30分鐘后，其熒光強度仍保持初始值的≈90%，而吲哚菁綠（ICG）的熒光強度則降至40%以下，凸顯了Ag₂Se量子點在長時程NIR-II成像中的優(yōu)越穩(wěn)定性。接著在1%脂乳仿體中進一步評估其深層成像能力，S-QD（采集波段900–1150 nm）的散射和背景信號高于L-QD（1290–1700 nm），但其更高的亮度補償了這些影響，使二者均實現(xiàn)了≈6 mm的成像深度。

如圖3b所示，僅通過切換濾光片（SP1150和LP1290），即可在混合樣品中準確區(qū)分S-QD和L-QD信號。細胞毒性通過MTT實驗（和活/死細胞染色）評估。S-QD和L-QD均表現(xiàn)出低細胞毒性，在4T1細胞中分別于200 µg mL⁻¹和300 µg mL⁻¹濃度下仍維持超過90%的細胞活力�；�/死染色圖像進一步佐證了上述結果：孵育12和24小時后，紅色染色的死細胞極少，表明細胞活力極高。這些結果證實了聚（氨基酸）包覆的S-QD和L-QD具有低細胞毒性。

在S-QD濃度為0.4 mg mL⁻¹、L-QD濃度為0.6 mg mL⁻¹時，溶血率均低于5%，證實其具有良好的血液相容性。研究者首先按照圖3c所示方案進行了雙色血管-淋巴管成像。由于較長的發(fā)射波長可實現(xiàn)更深的組織穿透和更高的信背比（SBR），L-QD經(jīng)靜脈注射用于高分辨率可視化微血管網(wǎng)絡。如圖3d所示，該通道可清晰區(qū)分體內兩條相鄰的小血管，其寬度分別為0.39 mm和0.47 mm（圖3e）。短波長發(fā)射的S-QD用于淋巴結（LNs）成像。進一步的多通道融合圖像揭示了血管與淋巴結的空間關系，其中一處共定位的1.87 mm淋巴結與相鄰的血管（寬度分別為0.46 mm和0.8 mm）清晰可辨（圖3e），這種解剖細節(jié)水平是單色成像無法實現(xiàn)的。該雙色平臺亦被拓展至胃腸道成像（圖3f）。線剖面分析顯示腸管寬度約為3.25 mm，SBR為1.6（圖3g）。為最大化雙色探針應用價值，開展了淋巴結的多路復用與比率成像（圖3h）。將尺寸匹配的S-QD與L-QD共注射至小鼠足墊，可高效共定位至骶淋巴結（圖3i）。令人振奮的是，建立SP1150/LP1290信號比率模型有效消除了背景干擾（比率=0.93），將淋巴結檢測精度從融合圖像中的2.3 mm提升至比率偽彩圖像中的1.95 mm（圖3j）。這種自校準技術有望為精準轉移性淋巴結（MLNs）成像建立新范式。

圖4. 荷瘤小鼠和正常小鼠MLNs的比率檢測

為實現(xiàn)轉移性淋巴結（MLNs）的比率檢測，將S-QDs功能化修飾葉酸（SQD-FA），靶向4T1腫瘤細胞表面過表達的葉酸受體（圖4a）。共軛成功通過傅里葉變換紅外（FTIR）光譜驗證：盡管PSIOAm與FA-PEG-NH₂均顯示酰胺鍵（≈1600 cm⁻¹），SQD-FA在1100 cm⁻¹處出現(xiàn)新的C-O-C伸縮振動峰，為FA-PEG偶聯(lián)提供了直接證據(jù)（圖4b）。流體動力學直徑由31 nm增至37 nm，ζ電位由−38 mV升至−18 mV，進一步證實了有效的表面修飾。細胞攝取研究顯示，與非靶向S-QDs相比，4T1細胞孵育SQD-FA后NIR-II熒光顯著增強，驗證了葉酸受體介導的內吞作用（圖4c）。為評估探針在體內的性能，將SQD-FA與L-QD共注射形成比率對（Mix-QD）用于MLNs檢測（圖4d）。理論上，兩種量子點通過淋巴引流相似積累，在正常淋巴結（NLNs）中維持穩(wěn)定的SP1150/LP1290強度比。而腫瘤浸潤的MLNs則因主動靶向優(yōu)先滯留SQD-FA，導致比率顯著升高。為驗證此機制，通過足墊注射建立4T1-Luc轉移模型，生物發(fā)光成像在2周內確認淋巴結轉移（圖4e）。對生物發(fā)光淋巴結、正常淋巴結及腫瘤組織的組織學檢查（H&E染色）顯示MLNs呈現(xiàn)腫瘤樣形態(tài)（圖4f）。此外，Ki67免疫染色表明MLNs中增殖信號呈彌散分布（接近原發(fā)腫瘤），而正常淋巴結中Ki67表達微弱且局域化（圖4f），共同確認了其轉移狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)證實了生物發(fā)光檢測識別淋巴轉移的可靠性。有趣的是，利用L-QDs的NIR-II成像揭示了MLNs中的血管重塑：與正常淋巴結中單根血管（≈0.55 mm）相比，MLNs內血管更密集、更迂曲（0.52–0.76 mm）（圖4g,h），可能促進探針的增強遞送。

為評估診斷性能，在荷瘤與對照小鼠中進行動態(tài)成像與比率重建（圖4i）。盡管合并熒光圖像無法區(qū)分MLNs與NLNs，偽彩色比率圖卻能清晰分辨MLNs。定量分析顯示，所有淋巴結中兩個通道的信號均呈時間依賴性增強。在NLNs中，SQD-FA與L-QD的強度曲線高度一致（圖4j），均在≈30 min達峰（分別為初始強度的1.29倍與1.31倍），證實其藥代動力學行為相似。在MLNs中，兩種探針的時序趨勢與NLNs一致（圖4k），同樣在≈30 min達峰，但熒光增強更顯著（SQD-FA為2.4倍，L-QD為1.7倍），這可能源于血管密度增加與葉酸受體介導的歸巢效應。盡管絕對熒光強度存在部分不一致，比率信號在時間上保持高度穩(wěn)定，有效校正了個體強度差異。比率在MLNs中穩(wěn)定升高至≈1.41，而NLNs中始終低于1（圖4l），證明該比率策略對MLNs識別具有高靈敏度與高特異性。

圖5. 同一小鼠體內MLN和正常LN的比率成像

為進一步驗證比率成像策略的診斷可靠性與可重復性，研究者在同一只動物體內對轉移性淋巴結（MLNs）與對側正常淋巴結（NLNs）進行了配對檢測。選取三只單側攜帶MLNs的小鼠，注射SQD-FA/L-QD探針混合物（圖5a）。30分鐘后，采集雙通道熒光信號并處理生成偽彩色SP1150/LP1290比率圖（圖5b）。所有受試動物中，MLNs的比率值均顯著高于正常淋巴結（比率>1.4 vs <1），差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01，n=3），表明其具有穩(wěn)健的組內對比度與良好的可重復性。為驗證體內結果，對術中切除的淋巴結進行離體分析。生物發(fā)光成像確認了MLNs的成功切除（圖5c），而NIR-II熒光成像保留了體內觀察到的比率對比度（圖5d）。值得注意的是，離體成像消除了組織散射偽影，提供了更清晰的對比度，差異高度顯著（p<0.001，n=3）。在不同深度測量的比率信號顯示，體內較深淋巴結（≈2–3 mm）與離體表淺淋巴結（0 mm）的比率讀數(shù)均能可靠區(qū)分淋巴結狀態(tài)，證實該比率法有效最小化了影響單色成像的深度依賴性衰減。形態(tài)學上，MLNs明顯腫大，投影面積約為正常淋巴結的四倍（圖5e），符合病理性淋巴結腫大的特征。綜上，這些結果證實了比率成像平臺在實時術中識別與術后病理評估MLNs方面的高準確性、可重復性及雙模態(tài)轉化潛力。本探針利用MLNs與NLNs的攝取差異，在體內外均提供清晰對比。可激活策略（如酶或pH響應設計）有望進一步提升特異性，是未來優(yōu)化本比率平臺的有前景方向。

為全面評估體內生物相容性，分別在靜脈和口服給藥后開展了急性和長期毒性研究，發(fā)現(xiàn)量子點清除高效且長期滯留極少。注射后24小時，處死小鼠并進行血液學、生化及組織病理學分析。QD處理組與對照組在關鍵血液學參數(shù)上無顯著差異（n=3，圖5f），包括白細胞計數(shù)（WBC）、淋巴細胞計數(shù)（Lymph）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）和血小板計數(shù)（PLT），所有數(shù)值均在生理范圍內，表明系統(tǒng)毒性可忽略。同樣，血清生化指標未顯示肝腎功能損傷跡象（圖5h），主要器官的H&E染色未見凋亡、炎癥或結構異常（圖5i），進一步證實低急性毒性。QD處理組小鼠的體重變化軌跡與生理鹽水對照組全程一致（圖5j），表明無延遲性不良反應。綜上，這些結果證實了多路復用Ag₂Se量子點優(yōu)異的體內生物相容性，與體外結果一致，并凸顯其臨床轉化的廣闊潛力。

綜上，本研究通過以低空間位阻的TBP替代傳統(tǒng)TOP，構建了Ag₂Se量子點的理性合成策略，協(xié)同OT精準調控顆粒生長動力學。該配體工程策略實現(xiàn)了對量子點尺寸與發(fā)射的精確調控，首次覆蓋了整個NIR-II窗口（935–1710 nm），為Ag₂Se量子點迄今最寬的光譜調控范圍�；�于此可調發(fā)射特性，選用光譜互不干擾的S-QD（1040 nm）與L-QD（1305 nm）實現(xiàn)了血管、淋巴系統(tǒng)及胃腸道的雙色活體成像。在此雙發(fā)射框架基礎上，通過將S-QD功能化修飾葉酸以實現(xiàn)主動靶向，同時保留L-QD作為內參，構建了組分同源的比率成像平臺。該系統(tǒng)基于約0.9的比率閾值，可靠地區(qū)分了轉移性淋巴結（MLNs）與正常淋巴結（NLNs），在術中與術后場景中均展現(xiàn)出卓越的靈敏度、可重復性與穩(wěn)健性。本研究為Ag₂Se量子點的光譜工程與生物醫(yī)學應用開辟了新范式，為開發(fā)低毒性、多路復用的臨床診斷探針提供了堅實框架。

參考文獻

Ge W, Gao B, Li S, et al. Self‐Calibrated Identification of Metastatic Lymph Nodes Using Full‐NIR‐II Tunable Ag2Se Quantum Dots Engineered by Short‐Chain Phosphines[J]. Small, 2025, 21(50): e10056.

⭐️ ⭐️ ⭐️

動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

In Vivo Imaging System

⭐️ ⭐️ ⭐️

 恒光智影

上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為“國家高新技術企業(yè)”、“上海市專精特新中小企業(yè)”，獲國家科技部“重大科學儀器研發(fā)專項”支持，榮獲上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”科學儀器項目、上海市2025年度關鍵技術研發(fā)計劃“計算生物學”項目。

恒光智影，致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供先進的、一體化的成像解決方案。

專注動物活體成像技術，成像范圍覆蓋 400-1700 nm，同時可整合CT, X-ray，超聲，光聲，光熱成像等技術。

可為腫瘤藥理、神經(jīng)藥理、心血管藥理、大分子藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學儀器服務。