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常見細胞培養(yǎng)方案

本期推文聚焦 16 種細胞的培養(yǎng)及注意事項！

表 1. 疾病研究常用的實驗細胞。

U87MG 細胞

人腦星形膠質母細胞瘤細胞，具有上皮形態(tài)，是源自中樞神經系統惡性腫瘤的細胞系。增殖速度快、侵襲性強，還存在明顯的遺傳與表型異質性^[1]。

培養(yǎng)條件：DMEM 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清 FBS，1% 青霉素鏈霉素雙抗，2 mM L-谷氨酰胺^[2]。

注意事項：

1. 細胞貼壁能力較弱：消化時間短，嚴格把控時間 (細胞回縮、間隙變大且部分脫落時，加 2-3 mL 完全培養(yǎng)基終止消化)；試劑需充分預熱，避免室溫放置過久。
2. 易聚集成團：胰酶充分消化并吹散，鏡檢確認單細胞狀態(tài)；必要時用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿；避免密度過高、血清不適。
3. 血清要求高：選用高品質專用培養(yǎng)基及血清，保障生長速度與貼壁性。
4. 控制接種密度：傳代比例 1:2-1:4，70%-80% 密度時傳代；密度過低生長緩慢，過高易聚團。

MDA-MB-231 細胞

典型的三陰性乳腺癌 (TNBC) 細胞，具有高侵襲性和轉移性^[4]。

培養(yǎng)條件：Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素雙抗^[5]。

注意事項：

1. 接種密度：細胞生長偏慢，傳代比例推薦 1:2，避免密度過低。
2. 操作注意：對機械損傷敏感，消化吹打需輕柔、次數少，防止細胞形態(tài)異�；蛏�長受阻。

HGC-27 細胞

人胃癌細胞，來自于未分化胃癌，能產生并分泌黏液素^[7]。

培養(yǎng)條件：RPMI 1640 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，2 mM 谷氨酰胺，10 mM HEPES^[8]。

1. 定期換液與污染監(jiān)測：每 2-3 天換液，防止廢物堆積或 pH 波動；定期查細胞形態(tài)、增殖，排查污染。
2. 接種密度：傳代比例 1:2 ~ 1:4，70% - 80% 匯合度時傳代。
3. 控制胰酶消化時間：避免過長損傷細胞。
4. 凍存復蘇溫度要求：凍存緩慢降溫，復蘇快速升溫，減少損傷。
5. 復蘇后換液原則：24 小時后首次換液，避免頻繁操作。

H22 細胞

小鼠肝癌細胞，分離自小鼠腹水，為懸浮細胞，呈淋巴母細胞樣^[10]。

培養(yǎng)條件：RPMI-1640培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素雙抗^[11]。

 注意事項：

1. 小鼠飼養(yǎng)時長：腹水接種后，小鼠飼養(yǎng)時間以 5 天為佳；飼養(yǎng)過久易導致小鼠死亡，且腹水中紅細胞含量會顯著升高。
2. 細胞凍存前培養(yǎng)時間：分離得到的腹水細胞建議先體外培養(yǎng) 8 小時左右再進行凍存，既能有效去除殘留紅細胞，又可使細胞狀態(tài)調整至最佳。
3. 體外培養(yǎng)傳代周期：H22 細胞體外培養(yǎng)增殖時，需在 5 代內進行一次腹水培養(yǎng)；若長期體外傳代超過 5 代，細胞狀態(tài)會急速變差，碎片明顯增多。
4. 收集腹水紅細胞過多時，可以用紅細胞裂解液去除；用分離液分離細胞時，可多次分離篩選，保證細胞的純度。
5. 腹水接種后，腹水長出時間會因細胞活力、接種細胞量的不同而存在差異；可通過觀察小鼠狀態(tài)判斷接種是否成功，成功接種的小鼠活動力會出現明顯減弱。

CHO-K1細胞

中國倉鼠卵巢細胞，實驗中常用的一個細胞株，上皮樣細胞，培養(yǎng)條件簡單，貼壁強度適中，比較容易轉染^[12]。

培養(yǎng)條件：Ham's F-12 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清^[13]。

1. 接種前可將完全培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱平衡 15 min 以上，使 pH 穩(wěn)定在 7.0-7.6。
2. 消化時避免搖晃培養(yǎng)瓶，可 37℃ 孵育加速消化。
3. 血清蛋白可競爭性抑制胰酶活性。
4. 傳代比例為 1:4-1:8。
5. 凍存密度控制在 1-10×10? cells/mL。
6. DMSO 需最后添加，加完后迅速轉移至低溫環(huán)境梯度凍存。

Caco-2 細胞

人結腸腺癌細胞，貼壁生長，為多邊形或梭形，增殖速度較快^[15]。

培養(yǎng)條件：DMEM 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素雙抗，1% 非必需氨基酸^[16]。

1. 控制接種密度 2-4×10⁴ cells/cm2，密度過高/過低易導致分化異常或增殖延遲；80-90% 融合時傳代，間隔 3-5 天，避免頻繁操作。
2. 細胞貼壁速度較慢，尤其是復蘇初期，通常需要 2-3 天才能完成貼壁并鋪展，期間細胞易出現空泡結構。
3. 傳代時，需確保胰酶消化后細胞充分分散為單細胞，否則會影響后續(xù)貼壁效果。
4. 該細胞呈成團生長特性，細胞密度越高，胞體表面的空泡及黑點數量也會隨之增多。
5. 匯合度達 80% 時進行傳代，此時細胞雖成片分布，但實際密度已處于較高水平。
6. 若細胞過度匯合、生長過滿，會嚴重影響細胞狀態(tài)，傳代后易出現碎裂、死亡的情況。
7. 細胞培養(yǎng)時間越長，所需的胰酶消化時間也相應增加。

VSMC 細胞

血管平滑肌細胞，是構成血管壁中膜的核心細胞類型，在血管生理功能調節(jié)和病理重構中發(fā)揮關鍵作用^[18]。

培養(yǎng)條件：DMEM 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素雙抗^[19]。

1. 避免反復凍融，未用完凍存液需丟棄。
2. 細胞匯合度 80%~90% 時傳代，首次傳代 1:2 接種。
3. 消化時嚴格控制 0.05% 胰酶-EDTA 作用時間 (2~3 分鐘)，避免過度消化導致細胞成團或死亡；鏡下觀察細胞變圓、少量脫落時立即用含血清培養(yǎng)基終止。
4. 沿瓶壁緩慢吹打 20~30 次至單細胞懸液，避免垂直吹打和產生氣泡，減少機械損傷。
5. 選取對數生長期 (匯合度 70% 左右)、健康無污染的低代次細胞 (≤10 代) 凍存，避免老化細胞。

HUVEC 細胞

人臍靜脈內皮細胞源于臍帶靜脈組織，具有易消化解離、較快的增殖速度以及成熟的培養(yǎng)體系等特點^[21]。

培養(yǎng)條件：DMEM 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，4 mM L-谷氨酰胺^[22]。

1. 避免反復凍融，未用完凍存液需丟棄。
2. HUVEC 貼壁依賴基質，未包被會降低貼壁率 (原代細胞尤甚)。
3. 細胞匯合度 80%~90% (鋪路石樣鋪滿，無重疊 / 管腔樣結構)，避免過度匯合，會加速細胞老化。
4. 用寬口移液管沿瓶壁吹打，避免垂直吹打；密度過低可加 10ng/mL VEGF 促存活。

HCMEC/D3 細胞

永生化人腦微血管內皮細胞，貼壁生長，呈細長梭形。

培養(yǎng)條件：ECM 培養(yǎng)基，5% 胎牛血清^[24]。

 注意事項：

1. 細胞匯合度達 80% 時操作，按 1:2~1:3 比例傳代。
2. 細胞懸液 “Z” 字打入含 7ml 培養(yǎng)基的 10cm 皿，輕柔十字晃勻不超過 10 下，靜置后鏡檢再放入培養(yǎng)箱。
3. ECM細胞培養(yǎng)基含光敏成分，需避光 4℃ 保存，配制后 1 個月內用完。

PBMCs 細胞

人外周血單個核細胞，其中 70%-90% 是淋巴細胞，是適應性免疫和固有免疫的核心成分。單核細胞占 10%-30%，是固有免疫的重要組分^[25]。

 注意事項：

1. 樣本預處理
抗凝全血與等體積 PBS (或生理鹽水) 輕柔混勻，降低粘稠度。15/50 mL 離心管預先加入 Ficoll 分離液 (體積為全血的 1/2~1/3)，避免管壁殘留液滴。
 
2. 梯度離心
傾斜離心管，沿管壁緩慢將稀釋血加至 Ficoll 液上層，避免擾動界面。400×g、室溫離心 20~30 分鐘，離心機啟停速度調至最低。離心后自上而下分為：血漿/ PBS 層、白膜層 (PBMCs)、Ficoll 層、粒/紅細胞沉淀層。
 
3. 收集與洗滌 PBMCs
無菌移液管小心吸取白膜層 (1~2 mL)，轉移至新離心管，避免吸入上下層液體。加 10 mL 含 2% FBS 的 PBS，300×g 室溫離心 5 分鐘，棄上清，重復洗滌 1~2 次。若殘留紅細胞，加 2~3 mL ACK 裂解液室溫孵育 3 分鐘，再用 PBS 洗滌 1~2 次。
 
4. 細胞計數與保存
適量 RPMI 1640 培養(yǎng)基或 PBS 重懸細胞，過 70 μm 細胞篩。將 10 μL 細胞懸液用臺盼藍染色后在顯微鏡下計數，確定活細胞濃度。

BMDC 細胞

骨髓來源樹突狀細胞，從骨髓細胞誘導產生樹突狀細胞。

培養(yǎng)條件：RPMI-1640 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素雙抗，1% L-谷氨酰胺，0.1% β-巰基乙醇^[26]。

BMDC 如何誘導分化？

1. 向骨髓細胞培養(yǎng)基中加入重組小鼠 GM-CSF (終濃度 20ng/mL) 和 IL-4 (終濃度 10ng/mL)。
2. 37℃、5% CO?培養(yǎng) 2~3 天后，吸出部分上清，補充新鮮培養(yǎng)基及細胞因子。
3. 培養(yǎng) 5~8 天期間，按步驟 2 補加培養(yǎng)基和細胞因子；收集細胞至離心管，300×g 室溫離心 5min，棄上清。
4. 用含 10% FBS、20ng/mL GM-CSF、10ng/mL IL-4 的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基重懸細胞，計數后分裝至 T25 培養(yǎng)瓶，補加新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24~48h。
5. 細胞聚集成團后，輕柔吹打脫落，收集懸液即為成熟 BMDC。

RAW 264.7 細胞

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞，呈現出典型的巨噬細胞特征，多為圓形或不規(guī)則形，貼壁生長，適宜條件下出現偽足結構^[27]。

培養(yǎng)條件：DMEM 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素雙抗^[28]。

1. 極易發(fā)生極化，因此避免胰酶消化，防止誘導細胞分化；不使用 PBS 沖洗，避免刺激極化。
2. 細胞密度達 80%-90%、培養(yǎng)基變黃時及時傳代，避免密度過高或疊加成層引發(fā)自發(fā)分化。
3. 觀察細胞形態(tài)：圓形/橢圓形變?yōu)樗慕切位蛏斐鰝巫銜r，需立即傳代，少量分化屬正�，F象。
4. 嚴格使用指定培養(yǎng)基，血清不可隨意更換；室溫保持 18-25℃，避免低溫誘導極化。
5. 傳代代數控制在 15 代內，超過后代極化概率升高。

THP-1 細胞

源自人急性單核細胞白血病患者的外周血細胞系，未分化時呈圓形，懸浮生長。誘導分化為巨噬細胞后貼壁生長，呈梭形/多角形等扁平狀，是研究單核-巨噬細胞譜系的理想模型^[30]。

培養(yǎng)條件：RPMI-1640 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素雙抗，2 mM L-谷氨酰胺^[31]。

1. 凍存復蘇：THP-1 細胞復蘇難度高，凍存密度需保證 5×10?-10?個 /ml，避免密度過低導致復蘇后狀態(tài)差。
2. 細胞碎片：培養(yǎng)中出現碎片，可待細胞密度提升后通過低速離心去除。
3. 細胞聚團：少量聚團可待細胞密度擴大后自行改善；嚴重聚團可提高 FBS 用量或適度吹散。
4. 貼壁現象：傳代后輕微貼壁可輕吹收集或丟棄貼壁細胞；貼壁較多需檢查培養(yǎng)條件是否適宜。

Naive CD4⁺ T 細胞

小鼠脾臟細胞，是尚未接觸過抗原的 T 輔助細胞。采用磁珠分選方法進行分離，基于抗原和抗體特異性結合，利用表面偶聯特異性抗體，精準捕獲目標細胞，再通過磁場實現快速分離，具有純度高、操作簡便、對細胞活性影響小的特點^[33]。

培養(yǎng)條件：RPMI 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素鏈霉素雙抗，β-巰基乙醇^[34]。

『如何培養(yǎng)？』

1. 樣本準備：單細胞懸液 (如 PBMCs、組織消化液) 離心洗滌，用緩沖液重懸并調整濃度。
2. 磁珠孵育：按比例加入磁珠，4℃或室溫避光孵育 10-30 分鐘，期間輕柔混勻。
3. 磁場吸附：將離心管放入磁力架，靜置 2-5 分鐘，待磁珠細胞復合物完全吸附。
4. 洗滌純化：移除上清，加入緩沖液洗滌 2-3 次，每次吸附后棄上清。
5. 洗脫收集：脫離磁場，用適量緩沖液或培養(yǎng)基重懸細胞，獲得純化的目標細胞。

BMSCs 細胞

大鼠骨髓間充質干細胞，具有多向分化潛能。

培養(yǎng)條件：DMEM 低糖培養(yǎng)基，10% 胎牛血清^[35]。

『如何培養(yǎng)？』

1. 完全培養(yǎng)基重懸細胞，T25 培養(yǎng)瓶接種 (密度 1×10?細胞 / 瓶)；
2. 37℃、5% CO?培養(yǎng)，靜置 24 小時后首次換液 (去除未貼壁細胞)；觀察長梭形、集落狀貼壁細胞。
3. 傳代：80% 融合時胰酶消化 2-3 分鐘 (鏡下見細胞回縮)，加含血清培養(yǎng)基終止，離心后重懸，按 1:2 或 1:3 接種；

GC-1 spg  細胞

小鼠精原細胞，上皮樣細胞，貼壁生長。

培養(yǎng)條件：DMEM 培養(yǎng)基，10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素雙抗^[36]。

『細胞傳代小妙招』

1. 細胞密度 >80% 時傳代，棄舊培養(yǎng)液。
2. PBS 輕柔沖洗細胞 2-3 次 (可搖晃培養(yǎng)瓶增強效果)。
3. 加預熱胰蛋白酶覆蓋細胞層，輕晃培養(yǎng)瓶助消化。
4. 鏡下觀察 90% 細胞脫落 (約 1min)，加 2-3ml 完全培養(yǎng)基終止消化。
5. 細胞懸液轉入 15ml 離心管，1200rpm 離心 3min。
6. 棄廢液，2ml 完全培養(yǎng)基重懸細胞后分裝至新瓶。十字晃動培養(yǎng)瓶使細胞均勻分布，置于 37℃、5%-10% CO? 培養(yǎng)箱。

Section.02
小結

不同細胞的培養(yǎng)需求各有差異，本期我們聚焦 16 種常用細胞，整理分享了實操性極強的培養(yǎng)經驗。希望這些干貨內容能切實幫到大家，讓細胞培養(yǎng)更順利、更高效！
 
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