SMI助力揭示Ewing肉瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的三重抵抗機(jī)制
一、文章背景
Ewing肉瘤（EwS）是一種好發(fā)于青少年的侵襲性骨腫瘤，盡管局灶期患者預(yù)后較好，但復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后的治療手段有限，生存率低，臨床亟需新的治療策略。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）在多種癌癥中取得成功，但在EwS中療效甚微，其機(jī)制尚不清楚。由于EwS發(fā)病率低，缺乏系統(tǒng)研究治療前后腫瘤微環(huán)境變化的樣本。本研究利用SARC028臨床試驗(yàn)中罕見(jiàn)的治療前后配對(duì)活檢樣本，結(jié)合多重空間組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)揭示了EwS對(duì)PD-1單藥免疫治療抵抗的微環(huán)境機(jī)制。
二、研究設(shè)計(jì)
本研究依托SARC028臨床試驗(yàn)的獨(dú)特樣本資源，系統(tǒng)分析了13位復(fù)發(fā)/難治性Ewing肉瘤（EwS）患者在免疫檢查點(diǎn)抑制劑pembrolizumab治療前與治療8周后的腫瘤活檢樣本。共收集到37個(gè)組織切片，構(gòu)建組織芯片（TMA），開(kāi)展以下分析：
- 多重免疫熒光（mIF）：定量腫瘤中不同免疫細(xì)胞亞群的浸潤(rùn)程度，包括CD4⁺、CD8⁺ T細(xì)胞，F(xiàn)OXP3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，CD68⁺巨噬細(xì)胞，CD20⁺ B細(xì)胞，及CD45⁺總免疫細(xì)胞。
- GeoMx DSP空間蛋白組：檢測(cè)68種蛋白的表達(dá)，評(píng)估免疫調(diào)節(jié)變化�？偣卜治� 48個(gè)區(qū)域，包括：腫瘤區(qū)（依據(jù)NKX2.2+ 識(shí)別）、CD8⁺ T細(xì)胞區(qū)、CD68⁺巨噬細(xì)胞區(qū)與非陽(yáng)性間質(zhì)區(qū)。
- CosMx SMI空間轉(zhuǎn)錄組：通過(guò)單細(xì)胞水平的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，識(shí)別細(xì)胞亞群與空間鄰域。使用CosMx Human Universal Cell Characterization RNA Panel（1000-plex）
- 整合scRNA-seq數(shù)據(jù)：與已構(gòu)建的EwS腫瘤微環(huán)境單細(xì)胞圖譜整合，進(jìn)行細(xì)胞注釋。
本研究巧妙融合了三種空間組學(xué)技術(shù)，形成縱向-橫向聯(lián)動(dòng)的分析框架：mIF用于定量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，揭示免疫細(xì)胞總體變化；GeoMx DSP空間蛋白組學(xué)進(jìn)一步解析免疫調(diào)節(jié)蛋白的空間表達(dá)狀態(tài)與治療應(yīng)答的關(guān)系，提供蛋白水平的動(dòng)態(tài)信息；CosMx SMI空間轉(zhuǎn)錄組則在單細(xì)胞分辨率下描繪細(xì)胞類(lèi)型組成、空間鄰域結(jié)構(gòu)及腫瘤亞群的功能狀態(tài)，揭示免疫抵抗的關(guān)鍵機(jī)制。
研究設(shè)計(jì)三、核心發(fā)現(xiàn)
1.Pembrolizumab未能顯著提升EwS腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平
研究通過(guò)多重免疫熒光分析治療前后Ewing肉瘤腫瘤活檢樣本，評(píng)估T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等免疫亞群的浸潤(rùn)水平。結(jié)果顯示，pembrolizumab治療前后，腫瘤組織中CD45⁺總免疫細(xì)胞數(shù)量并無(wú)顯著變化，CD4⁺、CD8⁺、CD68⁺、FOXP3⁺等亞群數(shù)量也未見(jiàn)顯著波動(dòng)。在個(gè)體水平上，部分患者存在免疫細(xì)胞數(shù)量升高或下降的情況，但這種變化未與治療后腫瘤體積變化顯著相關(guān)。這一結(jié)果提示，單藥抗PD-1治療難以有效激活EwS患者的抗腫瘤免疫反應(yīng)，可能由于其本底免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平低，或缺乏免疫激活所需的關(guān)鍵信號(hào)。
pembrolizumab治療不會(huì)改變EwS總免疫細(xì)胞密度2. 免疫檢查點(diǎn)治療誘導(dǎo)免疫抑制蛋白上調(diào)，提示潛在的免疫負(fù)反饋
通過(guò)GeoMx DSP空間蛋白質(zhì)組技術(shù)對(duì)治療前后腫瘤組織中多個(gè)ROI區(qū)域進(jìn)行蛋白表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)治療后樣本中多個(gè)免疫抑制相關(guān)蛋白顯著上調(diào)，包括CD163、FOXP3、CTLA4、IDO1、LAG3等。盡管整體蛋白表達(dá)譜未呈現(xiàn)大幅變化，仍可觀察到特定免疫調(diào)控蛋白在腫瘤或間質(zhì)區(qū)增強(qiáng)表達(dá)的趨勢(shì)。這表明PD-1治療在EwS中可能誘導(dǎo)了反向免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，增強(qiáng)了免疫抑制狀態(tài)。又或是加劇了TME中既有的抑制性信號(hào)，從而削弱了T細(xì)胞激活與持續(xù)效應(yīng)。
空間蛋白質(zhì)組分析顯示PD-1阻斷治療后免疫抑制相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)3. 空間鄰域分析揭示免疫抵抗三聯(lián)征--高TGF-β、低IFN響應(yīng)、低HLA-I表達(dá)
結(jié)合CosMx SMI空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與整合后的scRNA-seq參考圖譜，研究構(gòu)建了10種空間細(xì)胞鄰域（cellular neighborhoods, CN）。其中CN10鄰域在多個(gè)免疫治療失敗患者中反復(fù)出現(xiàn)，其主要由兩類(lèi)腫瘤細(xì)胞亞群（c1與c4）構(gòu)成。這些腫瘤細(xì)胞亞群具有顯著的TGF-β信號(hào)活性增強(qiáng)、HLA class I分子表達(dá)缺失、干擾素應(yīng)答能力低下等特征。進(jìn)一步分析顯示，HLA-I表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度及IFN信號(hào)呈正相關(guān)，且在EwS細(xì)胞系中可通過(guò)外源IFN-γ刺激恢復(fù)HLA-I表達(dá)。這提示CN10所代表的免疫抑制三聯(lián)征極可能是導(dǎo)致EwS原發(fā)性抗PD-1治療失敗的核心機(jī)制，同時(shí)也指出了可能的逆轉(zhuǎn)方向--靶向TGF-β、增強(qiáng)IFN響應(yīng)與抗原呈遞通路。
空間分辨的腫瘤鄰域揭示驅(qū)動(dòng)Ewing肉瘤抗PD-1治療抵抗的免疫抑制軸四、小結(jié)
這項(xiàng)研究提供了迄今為止最全面的Ewing肉瘤免疫微環(huán)境空間圖譜，首次明確了治療失敗后腫瘤躲避免疫的三重機(jī)制：TGFβ激活、IFN反應(yīng)缺失、HLA-I表達(dá)降低。該文章也提出了幾點(diǎn)建議：
- 聯(lián)合療法是未來(lái)方向，例如聯(lián)合TGFβ抑制劑、放療、激活I(lǐng)FN通路等
- 考慮非HLA依賴(lài)的免疫策略，如CAR-T等
- 空間組學(xué)為研究罕見(jiàn)腫瘤療效耐藥提供新的研究路徑
- 在免疫治療臨床試驗(yàn)中，動(dòng)態(tài)獲取患者治療前后的腫瘤樣本是至關(guān)重要的。
- 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的原理、核心組件、關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)、應(yīng)用與發(fā)展方向
- 單細(xì)胞蛋白組Abseq聯(lián)合流式技術(shù)在解鎖腫瘤與感染免疫差異中的應(yīng)用
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