肝臟對(duì)全身應(yīng)用AAV有較高的親合性，AAV在肝臟中的注射方式分為直接傳送和外周傳送兩種（下表所示），其中尾靜脈注射和腹腔注射是目前應(yīng)用比較廣泛的注射方式，操作者也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的注射方式。

圖一：小鼠肝臟中AAV給藥途徑示意圖

（A）小鼠側(cè)視圖，顯示側(cè)尾靜脈或眶靜脈竇注射路線；（B）小鼠仰臥位圖，顯示非手術(shù)腹膜內(nèi)和手術(shù)肝內(nèi)、脾內(nèi)和門靜脈輸送路徑。

圖二：推薦的AAV肝臟注射方式和血清型種間比較

在此，我們介紹一下幾種常用的注射方式，肝門靜脈注射、肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注射、尾靜脈注射以及新生小鼠靜脈注射的操作步驟供大家參考。

1. 肝門靜脈注射

（1）通過腹腔注射麻醉劑將成年小鼠麻醉，對(duì)小鼠腹部局部區(qū)域做去毛及消毒處理；

（2）在距劍突軟骨下方2-3mm處，做一個(gè)2-3cm的中線切口。

（3）暴露門靜脈，使用30G針頭在1min內(nèi)均勻緩慢注射0.2 ml病毒懸液。

注：門靜脈是一種相對(duì)較大的靜脈，提起肝前葉一般即可看到門靜脈。在手術(shù)過程中，用浸泡在生理鹽水中的無菌紗布覆蓋腸道，保持腸道濕潤。

（4）注射后保持針位約10-20秒。取出針后，做好防出血處理；

（5）縫合腹部，將小鼠放置于加熱燈下，直至恢復(fù)意識(shí)。然后將其放回籠子單獨(dú)飼養(yǎng)，直到傷口完全愈合。

2. 肝內(nèi)注射

（1）通過腹腔注射麻醉劑將成年小鼠麻醉，對(duì)小鼠腹部局部區(qū)域做去毛及消毒處理；

（2）在距劍突軟骨下方2-3mm，做一個(gè)2-3cm的中線切口，以露出肝臟。

（3）用固定在結(jié)核菌素注射器上的30G針頭將病毒懸液緩慢注入肝實(shí)質(zhì)中。

注:在注射過程中通過手術(shù)立體鏡監(jiān)測(cè)注射部位，確保無出血或外滲。如果出現(xiàn)上述任何一種情況，需取出針頭，輕輕按壓止血，然后選擇一個(gè)新的部位進(jìn)行注射。

（4）取出針，用無菌紗布輕輕按壓止血。

（5）再選擇其他部位進(jìn)行注射。

注：一只成年小鼠一次可選擇4 ~ 5個(gè)不同的注射位點(diǎn)(40 ~ 50μl/site)，總劑量可達(dá)200μl。

（6）縫合腹部，將小鼠放置于加熱燈下，直至恢復(fù)意識(shí)。然后將其放回籠子單獨(dú)飼養(yǎng)，直到傷口完全愈合。

3. 尾靜脈注射

（1）將小鼠放在標(biāo)準(zhǔn)限制器中，使注射器能夠完全接觸到整個(gè)尾巴長度。

（2）將一根30G的針頭固定在1cc結(jié)核菌素注射器上，盡可能遠(yuǎn)的插入尾部側(cè)面靜脈。選擇一個(gè)遠(yuǎn)端部位，如果第一次注射失敗，可以選擇另一個(gè)更近端的注射部位。

注：a：小鼠尾巴上較容易接觸到的靜脈位于尾巴的側(cè)面，且側(cè)靜脈非常淺，無需進(jìn)針很深；小鼠尾部背面的靜脈很難常規(guī)注射；尾部腹面的血管是動(dòng)脈，不可注射。

b：注射前用溫水輕輕地加熱尾巴，可以使血管得到一定程度的舒張，便于注射。

（3）針頭到位后，緩慢注射病毒懸液。

注: 如果注射器由于壓力增加而難以壓下柱塞，此時(shí)很可能針頭不在靜脈中。在這種情況下，應(yīng)取下針頭并選擇一個(gè)新的位置重新注射。

（4）注射完成后取下針頭，輕輕按壓止血，然后立即將小鼠放回籠中。

注：使用此方法注射成年小鼠，病毒用量控制在300 - 400μl較佳。

4. 新生小鼠靜脈注射

（1）需兩個(gè)人配合完成，一人固定，一人注射；

（2）注射前將小鼠置于干毛巾上，減少活動(dòng)及損傷；

（3）一人輕輕固定小鼠，使側(cè)面朝上，暴露眼睛至頸部的顳淺靜脈，置于放大鏡下；

（4）另一人沿著自頭至頸的方向?qū)?0G的注射針頭插入靜脈旁的皮下，慢慢推進(jìn)靜脈（新生鼠皮膚呈現(xiàn)半透明，較易觀察）；

（5）慢慢注射病毒懸液；（如果注射成功，注射部位遠(yuǎn)端靜脈會(huì)呈白色，如果未成功，皮下注射10μl即可看到明顯的隆起）

（6）注射完成后，取下針頭，輕輕按壓靜脈，通常2-3分鐘會(huì)停止出血；

（7）將新生鼠在加熱燈下照射后，放回母鼠身邊；

（8）如果注射不成功，讓小鼠恢復(fù)5-10分鐘，然后在另一側(cè)嘗試第二次注射；

注：使用此方法注射新生小鼠，病毒用量控制在100μl以內(nèi)較佳。