dCas9（dead Cas9）是 Cas9 蛋白的突 變 體， 即 因 Cas9 的 RuvC1 和 HNH 兩個(gè)核酸酶活性區(qū)域同時(shí)發(fā)生突變產(chǎn)生，其剪切酶活性喪失，只保留了由 gRNA 引導(dǎo)進(jìn)入基因組的能力。目前，CRISPR/dCas9 系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控、 基因組成像、表觀遺傳調(diào)控等方面。

p-dCas9 蛋白 RuvC1 ( D10A ) 和 HNH ( H841A ) 結(jié)構(gòu)域突變，核酸酶功能喪失

dCas9 和普通 Cas9 的核心區(qū)別

dCas9 系統(tǒng)能用來(lái)干什么？

dCas9 本身只是 “定位器”，真正強(qiáng)大的是給它接上各種功能蛋白，形成一套工具系統(tǒng)。

1. 基因抑制：CRISPRi

dCas9 可以結(jié)合目標(biāo)基因組 DNA 序列，產(chǎn)生空間位阻，阻止其他 DNA 結(jié)合蛋白（如內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子和 RNA 聚合酶 II）的活性，從而干擾基因表達(dá)（CRISPR interference，CRISPRi）。在細(xì)菌中，使用基于 dCas9 的 CRISPRi 方法可以高效抑制基因表達(dá)，特異性高、脫靶率低， 并且可以利用多個(gè) sgRNAs 同時(shí)控制多個(gè)基因。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，將 dCas9與強(qiáng)阻遏復(fù)合物如 Kruppel 相關(guān)盒融合會(huì)誘導(dǎo)其產(chǎn)生更強(qiáng)及更特異性的轉(zhuǎn)錄抑制。與 Cas9 誘導(dǎo)的永久性基因修飾不同，CRISPRi 對(duì)基因的抑制是可逆的。

2. 基因激活：CRISPRa

CRISPR 介導(dǎo)的基因激活稱(chēng)為 CRISPRa（CRISPR activation），利用 dCas9 融合蛋白招募轉(zhuǎn)錄激活因子，dCas9 與大腸桿菌聚合酶的 ω- 亞基融合，可將全酶組裝在目標(biāo)啟動(dòng)子上，用于轉(zhuǎn)錄激活。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，將dCas9 與 VP64 或 p65 激活域（p65AD）融合可以在僅一條 sgRNA 引導(dǎo)條件下同時(shí)激活報(bào)告基因和內(nèi)源性基因。

3. 基因位點(diǎn)示蹤：活細(xì)胞 DNA 成像

dCas9 帶上熒光蛋白（如 GFP、mCherry），可以實(shí)時(shí)觀察特定染色體區(qū)域在細(xì)胞內(nèi)的位置，或者研究端粒、著絲粒、異染色質(zhì)動(dòng)態(tài)等。

4. 表觀遺傳修飾

dCas9 連接DNA 甲基化酶 / 去甲基化酶、組蛋白乙酰化 / 去乙�；�酶，可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)表觀編輯，不改變序列，只改變表達(dá)狀態(tài)。

5. 染色質(zhì)互作研究

dCas9 結(jié)合生物素標(biāo)記、 proximity labeling 等，用來(lái)抓與靶位點(diǎn)相互作用的DNA、RNA、蛋白。