本文要點(diǎn)：高性能熒光染料的稀缺，仍是目前的近紅外二區(qū)成像領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻瓶頸�，F(xiàn)有染料普遍存在光吸收率低、發(fā)射效率差及合成繁瑣等問(wèn)題。本文提出了一種簡(jiǎn)明的兩步環(huán)化策略，以易得原料構(gòu)建了名為BM-engineered的新型高亮度近紅外二區(qū)染料家族。BM染料具有完全剛性和共平面的骨架，展現(xiàn)出優(yōu)異的摩爾消光系數(shù)（εDCM = 1.9–3.7 × 105 M–1 cm–1）、高熒光量子產(chǎn)率（DCM中ΦF = 10.4–18.0%）以及顯著的光化學(xué)穩(wěn)定性。值得注意的是，BM3以其卓越的近紅外二區(qū)光學(xué)性能（ε = 3.7 × 105 M–1 cm–1，ΦF = 18.4%）重新定義了該領(lǐng)域的光學(xué)性能標(biāo)準(zhǔn)，成為迄今報(bào)道的最亮近紅外二區(qū)熒光染料。憑借這一優(yōu)勢(shì)，BM3在超低劑量下即可實(shí)現(xiàn)高分辨率生物成像，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)腦血管（3 nmol）和淋巴管（75 pmol）成像，還能精確檢測(cè)缺血再灌注模型中微小的腦毛細(xì)血管損傷。更引人注目的是，BM3首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)化學(xué)和細(xì)菌刺激引發(fā)的炎癥淋巴系統(tǒng)的精確實(shí)時(shí)追蹤，揭示了先前難以捉摸的不同病理生理模式。本研究不僅開(kāi)創(chuàng)了一種面向超亮近紅外二區(qū)熒光染料的簡(jiǎn)化合成策略，而且拓展了生物成像精度和疾病診斷的前沿，為生物醫(yī)學(xué)創(chuàng)新和臨床應(yīng)用釋放了巨大潛力。

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本文針對(duì)近紅外二區(qū)熒光成像領(lǐng)域面臨的核心瓶頸——高性能熒光染料稀缺（存在摩爾消光系數(shù)低、量子產(chǎn)率低、合成復(fù)雜等問(wèn)題），提出了一種創(chuàng)新的解決方案。作者團(tuán)隊(duì)受前期研究啟發(fā)，利用易得的商業(yè)化原料和簡(jiǎn)單的兩步合成法(圖1)，開(kāi)發(fā)出了一種名為BM染料的新型高亮度近紅外二區(qū)熒光骨架。BM染料的關(guān)鍵設(shè)計(jì)在于其完全剛性和共平面的稠環(huán)結(jié)構(gòu)，這與傳統(tǒng)柔性骨架的染料形成鮮明對(duì)比。這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)帶來(lái)了多重優(yōu)勢(shì)：1）極高的摩爾消光系數(shù)（BM3達(dá)3.7 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹）；2）高熒光量子產(chǎn)率（BM3在DMSO中達(dá)18.4%），有效抑制了非輻射衰變；3）卓越的光穩(wěn)定性。其中，BM3的綜合亮度超越了所有已報(bào)道的近紅外二區(qū)分子，刷新了該領(lǐng)域的性能紀(jì)錄。作為概念驗(yàn)證，BM3在極低劑量下即實(shí)現(xiàn)了高質(zhì)量的腦血管和淋巴管成像，性能優(yōu)于現(xiàn)有市售染料，并首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)炎癥淋巴系統(tǒng)的精確實(shí)時(shí)追蹤。該研究不僅提供了一種簡(jiǎn)捷高效的高亮度染料構(gòu)建策略，也通過(guò)實(shí)驗(yàn)與計(jì)算分析揭示了分子結(jié)構(gòu)與光學(xué)性能的關(guān)聯(lián)，為下一代近紅外二區(qū)熒光探針的理性設(shè)計(jì)指明了方向，對(duì)推動(dòng)高精度生物成像和疾病診斷具有重要意義。

圖1. 以常見(jiàn)原料（水楊醛和環(huán)己酮衍生物）為起始材料，通過(guò)簡(jiǎn)潔的合成路線合理設(shè)計(jì)NIR-II熒光團(tuán)骨架。

羅丹明和花菁染料是廣泛使用的陽(yáng)離子染料，以其可調(diào)諧的波長(zhǎng)、高摩爾吸光度和強(qiáng)熒光發(fā)射而聞名，使其成為熒光成像和光療的理想選擇。這些染料通常具有大而剛性的共軛骨架，π電子在分子結(jié)構(gòu)上幾乎均勻分布（圖2a）。通過(guò)引入不同的取代基或改變共軛長(zhǎng)度，可以調(diào)整其光物理性質(zhì)（λabs/em、ΦF和ε等）。值得注意的是，這些染料采用非極性基態(tài)，尤其是在極性介質(zhì)中。在此狀態(tài)下，π電子密度分布是對(duì)稱的，導(dǎo)致正電荷離域化和最小的鍵長(zhǎng)交替。這種結(jié)構(gòu)排列減少了激發(fā)態(tài)與基態(tài)之間的振動(dòng)耦合，有助于最小化非輻射衰變途徑。這些特性因此賦予了它們強(qiáng)的光吸收和有利的發(fā)射性質(zhì)。

圖2. (a) 花菁和羅丹明染料的對(duì)稱π電子分布。(b) BM染料的設(shè)計(jì)策略。(c) BM染料的合成路線。(d) BM0、BM1、BM2和BM3的靜電表面電勢(shì)。(e) 被各種立體、給電子和吸電子基團(tuán)取代的BM染料的不同結(jié)構(gòu)。

首先研究者采用計(jì)算分析來(lái)指導(dǎo)染料骨架的設(shè)計(jì)，旨在避免不必要的試錯(cuò)。為了研究不同"橋"構(gòu)型的影響，模擬了兩種參考化合物，Dye1 (D1) 和 Dye2 (D2)，如圖2b所示。對(duì)于D1，聚甲炔橋未能完全環(huán)化，導(dǎo)致其在基態(tài)下呈現(xiàn)扭曲和非平面結(jié)構(gòu)，預(yù)示著較差的化學(xué)穩(wěn)定性。此外，在光激發(fā)下，D1易于形成以完全電荷分離為特征的TICT態(tài)，使其既無(wú)熒光又化學(xué)不穩(wěn)定。進(jìn)一步設(shè)計(jì)了BM，通過(guò)用sp2雜化的氧橋原子取代兩個(gè)–C(CH3)2–基團(tuán)，旨在減少分子扭曲。正如預(yù)期的那樣，經(jīng)計(jì)算分析證實(shí)，BM確實(shí)展現(xiàn)出更好的平面性。

如圖2b所示，BM染料具有線性結(jié)構(gòu)和對(duì)稱的π電子分布。它們由烷基取代的苯胺作為給體、聚甲炔作為橋連以及在整個(gè)骨架上離域的正電荷組成。與傳統(tǒng)的NIR-II花菁染料中裸露的甲炔基以及羅丹明染料中的稠合多環(huán)相比，BM染料中的共軛雙鍵通過(guò)并入剛性的六元脂環(huán)得到穩(wěn)定。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有效抑制了困擾傳統(tǒng)花菁染料的旋轉(zhuǎn)、構(gòu)象轉(zhuǎn)變和光異構(gòu)化，從而顯著增強(qiáng)了它們的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和電子穩(wěn)定性。此外，稠環(huán)數(shù)量的戰(zhàn)略性減少和氧原子的引入緩解了過(guò)度親脂性和π–π堆積的問(wèn)題。這種方法協(xié)同增強(qiáng)了光捕獲能力（ε）和發(fā)射效率（ΦF），最終實(shí)現(xiàn)卓越的亮度。

本研究的主要目標(biāo)是構(gòu)建具有高亮度以及簡(jiǎn)化合成步驟的NIR-II染料骨架。如圖2c所示，采用了兩步合成法：（1）通過(guò)‌Domino Oxa–Michael–Aldol 縮合反應(yīng)生成酮中間體，（2）該中間體與不同的芳基鋰試劑反應(yīng)，酸化后得到一系列BM染料。BM3以環(huán)狀氨基作為末端取代基，相較于BM1和BM2表現(xiàn)出更優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)，包括紅移的吸收/發(fā)射峰、更高的摩爾吸光度和量子產(chǎn)率，這歸因于其增強(qiáng)的給電子能力和構(gòu)象約束�；�于這一優(yōu)化的核心結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)內(nèi)消旋苯環(huán)進(jìn)行官能化，進(jìn)一步豐富了BM骨架的多樣性（圖2e），引入了空間位阻基團(tuán)（BM4–6）、給電子基團(tuán)（BM7–8）和吸電子基團(tuán)（BM9–10）。該系列化合物使研究者能夠系統(tǒng)研究結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系，并精細(xì)調(diào)控光物理行為（圖3a,b）。

圖3. BM1–6的光譜表征。

獲得了這些染料后，首先研究了它們的光物理性質(zhì)。這些染料在各種溶劑中的吸收和發(fā)射光譜如圖3，相應(yīng)的光物理數(shù)據(jù)總結(jié)于圖3i中。可以觀察到，所有三種染料在600 nm至900 nm之間均表現(xiàn)出強(qiáng)的NIR吸收，并且隨著氨基取代基給電子能力的增強(qiáng)，染料的吸收最大值（λabs）按BM1 < BM2 < BM3的順序逐漸紅移，這一趨勢(shì)在不同溶劑中保持一致。具體而言，BM1、BM2和BM3在CH2Cl2中的吸收最大值分別為852 nm、858 nm和895 nm。此外，剛性的對(duì)稱結(jié)構(gòu)賦予了所有三種染料高的摩爾消光系數(shù)。BM1和BM2在CH2Cl2和CHCl3中的ε值超過(guò)3.0 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹，而B(niǎo)M3在CHCl3中達(dá)到更高的值，為3.7 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)類似光譜范圍內(nèi)大多數(shù)已報(bào)道的NIR-II熒光染料。BM3光學(xué)性能的穩(wěn)健性體現(xiàn)在即使在甲醇中（一種常會(huì)破壞電子對(duì)稱性的極性溶劑），其仍保持高的ε（2.8 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹）。

當(dāng)從有機(jī)環(huán)境過(guò)渡到水相環(huán)境時(shí)，它們的光物理行為出現(xiàn)了有啟示性的差異。如圖S3和S4所示，BM1和BM2保留了與在有機(jī)溶劑中相似的光譜特征，盡管由于水的高極性而發(fā)生了適度的藍(lán)移和ε降低，例如，BM1從DCM中的852 nm移動(dòng)到PBS中的830 nm。然而，BM3呈現(xiàn)出顯著的對(duì)比：其大而剛性的平面結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)了明顯的H-聚集，嚴(yán)重?fù)p害了其溶解度。雖然在PBS中在885 nm附近仍可觀察到微弱的吸收（圖3f），但主導(dǎo)的最大吸收峰急劇藍(lán)移至733 nm。采用分子分散策略，使用Tween 80作為助溶劑。值得注意的是，僅在PBS中引入0.01%的Tween 80就引起了顯著的光譜恢復(fù)：BM3的λabs從733 nm激增至896 nm，同時(shí)ε恢復(fù)到1.1 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹。進(jìn)一步提高Tween 80濃度帶來(lái)的變化可忽略不計(jì)，表明其已完全恢復(fù)到單體狀態(tài)。

接下來(lái)，進(jìn)一步研究了它們的熒光性質(zhì)。如圖3d、所示，三種染料在不同溶劑中的最大熒光波長(zhǎng)（λem）范圍為870 nm至930 nm。具體而言，BM1、BM2和BM3在CH₂Cl₂中的發(fā)射最大值分別位于879 nm、893 nm和912 nm。所有三種染料均隨溶劑極性增加而表現(xiàn)出輕微的發(fā)射藍(lán)移；例如，BM1的λem從CH₂Cl₂中的879 nm移動(dòng)到甲醇中的866 nm。令人滿意的是，BM1和BM2在PBS中表現(xiàn)出優(yōu)異的溶解性，并保持了與有機(jī)溶劑中相當(dāng)?shù)母邿晒鈴?qiáng)度，盡管其λem值略有藍(lán)移（圖3e）。然而，BM3表現(xiàn)出明顯不同的行為：在PBS中的嚴(yán)重聚集極大地猝滅了其發(fā)射（圖3g）。引人注目的是，在加入Tween 80后，BM3在PBS中的熒光強(qiáng)度激增近10倍，達(dá)到與甲醇中相當(dāng)?shù)牧炼人�平。這種改善伴隨著λem的顯著紅移，從DCM中的912 nm移動(dòng)到Tween 80溶液（0.5%）中的933 nm，反映了其單體形式的恢復(fù)。

隨后，研究者進(jìn)一步評(píng)估了BM1、BM2和BM3相對(duì)于基準(zhǔn)染料ECXb的相對(duì)熒光量子產(chǎn)率（ΦF）。從圖3i可以看出，所有三種染料在有機(jī)溶劑中均表現(xiàn)出高的ΦF，在鹵代溶劑（CH₂Cl₂、CHCl₃和1,2-二氯乙烷）中的值超過(guò)10%。其中，BM3在DMSO中顯示出最高的ΦF，為18.4%。盡管在極性溶劑中ΦF有所下降，BM3在甲醇中仍保持相對(duì)較高的ΦF，為4.4%，優(yōu)于大多數(shù)已報(bào)道的NIR-II分子。即使在發(fā)生嚴(yán)重聚集誘導(dǎo)猝滅的PBS中，BM3仍保持可測(cè)量的ΦF，為0.6%。引人注目的是，加入Tween 80作為增溶劑后，其ΦF激增近9倍，達(dá)到非凡的5.4%，凸顯了聚集控制在釋放該染料全部發(fā)射潛力中的關(guān)鍵作用。

為了評(píng)估固有亮度（ΦF × ε），進(jìn)一步計(jì)算了三種染料在不同溶劑中的亮度值。如圖3i、所示，BM1、BM2和BM3在各種溶劑中的亮度值均超過(guò)10⁴ M⁻¹ cm⁻¹。值得注意的是，BM3在CH₂Cl₂中達(dá)到了6.4 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹的卓越亮度，躋身迄今報(bào)道的最亮NIR-II熒光染料之列。即使在甲醇和Tween 80溶液（0.5%）中，BM3仍保持高值，分別為1.2 × 10⁴和0.6 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹�？傮w而言，與BM1和BM2相比，BM3在各種溶劑中表現(xiàn)出更優(yōu)越的光物理性質(zhì)，包括更長(zhǎng)的λabs和λem、更大的ε以及更高的ΦF。在相同光譜范圍內(nèi)，BM3名列前茅，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于先前報(bào)道的NIR-II染料。

圖4. BM3 and ECXb in CH2Cl2的理論計(jì)算和光譜表征

一般來(lái)說(shuō)，εmax主要由兩個(gè)參數(shù)決定：振子強(qiáng)度（f）以及紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜的半高全寬（fwhm）。通過(guò)計(jì)算表明， BM3的f值為1.8536，與ECXb（1.6938）相比更大。BM3的f值較大源于電荷離域化增強(qiáng)，這體現(xiàn)在沿所標(biāo)示聚甲炔鏈的BLA值�。�0.033），以及在HOMO → LUMO躍遷過(guò)程中電荷轉(zhuǎn)移距離dCT極�。�0.706 Å）（圖4a、b）。此外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜中，BM3比ECXb表現(xiàn)出更窄的fwhm（BM3為667 cm⁻¹，ECXb為703 cm⁻¹，圖4c）。

fwhm量化了紫外-可見(jiàn)-近紅外光譜的展寬程度。小的fwhm有助于提高εmax。fwhm的增加（或紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜的展寬）主要?dú)w因于溶劑-染料相互作用。較小的fwhm值表明BM3經(jīng)歷的染料-溶劑相互作用弱于ECXb。這很可能是由于BM3中的π共軛網(wǎng)絡(luò)比ECXb中的更�。ㄓ帽交�片段替換了萘）。出于同樣的原因，研究者還注意到在熒光光譜中BM3的fwhm也小于ECXb（BM3為698 cm⁻¹，ECXb為736 cm⁻¹，圖4c）。增強(qiáng)的振子強(qiáng)度f(wàn)和減小的fwhm共同促成了BM3 εmax的提高。

接著還分析了BM3相比ECXb具有更高量子產(chǎn)率的分子原因。為此，計(jì)算了BM3和ECXb在S₁態(tài)的Huang–Rhys (HR)因子 （圖4d）。HR因子表征了電子-聲子耦合強(qiáng)度，大的HR因子（尤其是在熱可達(dá)的低頻區(qū)域，即<200 cm⁻¹）表明顯著的非輻射衰變。計(jì)算顯示，ECXb在7.83 cm⁻¹處表現(xiàn)出顯著更高的HR因子，為6.39，大約是BM3的六倍。ECXb中這個(gè)升高的HR因子主要?dú)w因于呫噸橋的旋轉(zhuǎn)自由度。相比之下，BM3中氧橋原子的引入有效限制了這種旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，從而降低了HR因子和非輻射衰變。表明了BM3具有比ECXb更高的量子產(chǎn)率。

圖5.（a）用不同的供電子基團(tuán)和吸電子基團(tuán)取代的BM染料的不同結(jié)構(gòu)。BM3，7-10在不同有機(jī)溶劑中的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜（b）和發(fā)射光譜（c）。BM3，7-10在含有0.5%吐溫80的PBS中的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜（d）、發(fā)射光譜（e）。

為了探索BM骨架的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系，研究者合成了一系列在內(nèi)消旋位具有不同空間和電子性質(zhì)的衍生物（BM4–10）（圖5a）。帶有空間位阻芳基的BM4–6表現(xiàn)出與BM3幾乎相同的光物理性質(zhì)（λabs/λem、ε、ΦF和τF），這與它們共享的核心結(jié)構(gòu)一致。例如，BM4和BM5在CH₂Cl₂中的λabs/λem分別約為901/930 nm和904/934 nm，并具有高的ΦF值，分別為13.5%和12.8%。出乎意料的是，BM4–6在Tween 80水溶液中均表現(xiàn)出相對(duì)較長(zhǎng)的熒光壽命，分別測(cè)得為0.54、0.55和0.31 ns，這可能是由于膠束環(huán)境中分子間相互作用被抑制所致。

接下來(lái)，研究者引入了給電子基團(tuán)（BM7，BM8）和吸電子基團(tuán)（BM9，BM10）。它們的光學(xué)性質(zhì)隨取代基的電子性質(zhì)發(fā)生系統(tǒng)性變化（圖5b，c）。給電子基團(tuán)引起藍(lán)移（例如，BM7在TCM中的λabs/λem：884/913 nm），而吸電子基團(tuán)引起紅移（例如，BM10：903/930 nm）。這種趨勢(shì)在Tween 80水溶液中被放大（圖5d，e）。BM7和BM10分別顯示出藍(lán)移和紅移的吸收和發(fā)射峰，位于880/920 nm和905/941 nm。盡管存在這些位移，所有衍生物在有機(jī)溶劑中仍保持了與BM3相當(dāng)?shù)母吣�爾吸光度和熒光量子產(chǎn)率。值得注意的是，BM8和BM10在PBS中形成了非發(fā)射的J-聚集體。

圖7. BM染料對(duì)氧化劑、還原劑、不同pH溶液中的吸收光譜和熒光光譜測(cè)試

BM染料的共軛聚甲炔骨架含有潛在的親電位點(diǎn)，理論上使其易受活性氧或親核試劑的降解。為了嚴(yán)格評(píng)估其化學(xué)穩(wěn)定性，將染料與一組氧化性試劑（ClO⁻、H₂O₂、ONOO⁻、•OH）和還原性試劑（GSH、Cys、SH⁻、HSO₃⁻）共同孵育。如圖7a、b所示，與ClO⁻（100 μM）、H₂O₂（100 μM）、ONOO⁻（100 μM）和•OH（100 μM）孵育1小時(shí)后，大多數(shù)BM染料保留了超過(guò)90%的原始吸光度，強(qiáng)烈表明它們對(duì)氧化應(yīng)激具有優(yōu)異的抵抗性。同時(shí)，當(dāng)暴露于強(qiáng)還原性環(huán)境（包括Cys（100 μM）、GSH（1000 μM）、SH⁻（100 μM）和HSO₃⁻（100 μM））時(shí)，大多數(shù)BM染料也表現(xiàn)出顯著的抵抗性。BM1和BM2的中等敏感性可能歸因于其末端氨基取代基的化學(xué)性質(zhì)，這可能促進(jìn)了替代的還原途徑。BM3及其類似物（具有剛化的環(huán)狀氨基）具有更優(yōu)異的穩(wěn)定性，進(jìn)一步證實(shí)了這種結(jié)構(gòu)依賴的反應(yīng)性。重要的是，測(cè)試中使用的還原試劑濃度與生理水平一致，而氧化試劑的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)典型的生理活性氧水平。因此，可以得出結(jié)論，BM染料（其中BM3最為突出）具有完全足以用于生物應(yīng)用的化學(xué)穩(wěn)定性。值得注意的是，分散劑Tween 80顯著增強(qiáng)了BM3的表觀pH穩(wěn)定性。在Tween 80溶液中，僅在pH > 11時(shí)才觀察到顯著的光譜變化（圖7c–e），表明膠束包封提供了額外的抗堿水解保護(hù)作用。

除了化學(xué)穩(wěn)定性，光穩(wěn)定性也是決定成像質(zhì)量的重要參數(shù)。本文系統(tǒng)評(píng)估了BM染料的抗光漂白能力，并與市售NIR-II染料ICG和IR1061作為參考化合物進(jìn)行了比較。如圖7f、g、所示，ICG和IR1061均經(jīng)歷了顯著的光降解，在連續(xù)照射僅15分鐘后，它們的吸光度就大幅下降。形成鮮明對(duì)比的是，所有BM染料均表現(xiàn)出卓越的光穩(wěn)定性。在相同照射后，BM染料的吸光度下降不到10%。進(jìn)一步研究BM3在不同有機(jī)溶劑（DCM、DMSO和MeOH）中進(jìn)行光穩(wěn)定性研究。在808 nm（330 mW cm⁻²）照射15分鐘后，僅觀察到吸收光譜的微小變化（圖7h），保留了超過(guò)90%的初始吸光度。即使在Tween 80水溶液中，當(dāng)照射功率增加到500 mW cm⁻²時(shí)，BM3仍保持了其原始吸光度的85%�？紤]到NIR-II熒光成像的典型激發(fā)功率很少超過(guò)100 mW cm⁻²，這種卓越的穩(wěn)定性凸顯了BM染料在長(zhǎng)時(shí)間、高質(zhì)量熒光成像中的應(yīng)用潛力，在這些應(yīng)用中，穩(wěn)定的信號(hào)保持至關(guān)重要�？傊�，這些結(jié)果凸顯了BM染料優(yōu)越的光物理性質(zhì)，標(biāo)志著它們是實(shí)際NIR-II成像應(yīng)用中有前景的候選材料。

圖8. BM染料的體外近紅外II區(qū)熒光成像

在將BM染料應(yīng)用于活體成像之前，系統(tǒng)評(píng)估了它們?cè)谒�溶液中的熒光性能，并以市售NIR-II染料（ICG和IR1061）作為參考化合物。使用NIR-II成像系統(tǒng)，在三種長(zhǎng)通濾光片下采集了相同濃度的BM染料和參考分子的熒光圖像。如圖8a–c所示，BM染料表現(xiàn)出強(qiáng)烈的NIR-II熒光，而參考化合物在相同條件下發(fā)射微弱信號(hào)。與填充參比染料的毛細(xì)管相比，填充BM染料的毛細(xì)管橫截面輪廓顯示出更優(yōu)的特征完整性和信背比。此外，定量分析顯示，不同BM染料在水溶液中的熒光強(qiáng)度排序與其在有機(jī)溶劑中測(cè)得的相對(duì)發(fā)射效率相匹配。接下來(lái)，采用組織模擬模型（1% Intralipid）來(lái)評(píng)估BM染料的高亮度如何轉(zhuǎn)化為深部組織成像性能。隨著穿透深度的增加，所有染料的圖像質(zhì)量都下降。值得注意的是，即使在超過(guò)5 mm的穿透深度，BM染料仍能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。表現(xiàn)最佳的BM3，在使用900 nm和1050 nm長(zhǎng)通濾光片時(shí)，通過(guò)8 mm的散射介質(zhì)仍能產(chǎn)生清晰可辨的熒光。該實(shí)驗(yàn)直接證明，BM染料的高固有亮度為其在深部組織成像應(yīng)用中提供了顯著優(yōu)勢(shì)。

鑒于其優(yōu)越的綜合性能，BM3被選用于生物相容性評(píng)估及進(jìn)一步的生物學(xué)研究。研究者首先驗(yàn)證了其高效的細(xì)胞攝取能力。孵育30分鐘（5 μM）后，所有受試細(xì)胞系均顯示出明亮的NIR-II熒光（圖8d）。通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡進(jìn)一步成像顯示，在HeLa和4T1細(xì)胞中（圖8e），大部分BM3定位于線粒體，皮爾遜相關(guān)系數(shù)超過(guò)70%證實(shí)了這一點(diǎn)。這種線粒體積累可能歸因于染料本身的親脂性和正電荷。

圖9. 體內(nèi)淋巴血管的近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像

具體而言，將BM3（75 pmol）皮內(nèi)注射至足墊后，染料在1分鐘內(nèi)通過(guò)兩條平行的傳入淋巴管迅速到達(dá)腘窩淋巴結(jié)，實(shí)現(xiàn)了淋巴結(jié)的快速清晰成像。隨后，染料進(jìn)一步通過(guò)傳出淋巴管流入骶淋巴結(jié)，使其顯影。如圖9a所示，BM3還能清晰區(qū)分聚集的側(cè)支淋巴管。多條側(cè)支淋巴管被BM3點(diǎn)亮，這些側(cè)支最終匯合成兩條到達(dá)腘窩淋巴結(jié)的主傳入淋巴管。BM3清晰地區(qū)分了各條淋巴管，并且很容易量化代表性淋巴管的半高全寬，兩條傳入淋巴管的fwhm分別為411 μm和313 μm（圖9b），側(cè)支淋巴管的fwhm分別為303 μm、332 μm、359 μm和202 μm（圖9c）。

為了進(jìn)一步展示BM3的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力，利用松節(jié)油和金黃色葡萄球菌感染構(gòu)建了兩種淋巴炎癥模型，并研究了淋巴系統(tǒng)的變化。不同的刺激導(dǎo)致淋巴系統(tǒng)發(fā)生不同的改變。在松節(jié)油刺激組中，淋巴結(jié)顯示腫脹，兩條平行的傳入淋巴管表現(xiàn)出明顯的增厚（圖9d）。兩條傳入淋巴管的fwhm（圖9e、f）分別為782 μm和301 μm，比對(duì)照組（378 μm和191 μm）寬得多（約2倍）。另一方面，金黃色葡萄球菌感染組在淋巴系統(tǒng)中誘導(dǎo)了更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。從圖9g中可以明顯看出，傳入和傳出淋巴管均腫脹增厚，約為正常組的1.5倍。感染組兩條傳入淋巴管的fwhm分別為578 μm和457 μm（圖9j），而對(duì)照組分別為395 μm和321 μm（圖9h）。此外，兩個(gè)淋巴結(jié)的體積顯著增大，同時(shí)熒光增強(qiáng)，腫脹至正常組的約3倍（圖9i）。統(tǒng)計(jì)比較顯示，金黃色葡萄球菌感染使淋巴管相對(duì)于對(duì)照組擴(kuò)張約1.8倍。這些發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著NIR-II熒光成像向前邁出了重要一步。這是首個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)由化學(xué)和細(xì)菌刺激誘導(dǎo)的炎癥淋巴網(wǎng)絡(luò)如此高分辨率成像的NIR-II熒光染料，揭示了兩種模型之間不同的病理生理模式。

圖10. 腦血管的活體NIR-II熒光成像

如圖10a、b所示，經(jīng)尾靜脈注射后，BM3在完整顱骨下清晰勾勒出細(xì)微的腦血管結(jié)構(gòu)，包括大腦下靜脈（ICV）、淺靜脈（SV）、上矢狀竇(SSS)和橫竇（TS）。進(jìn)一步分析顯示，兩條淺靜脈（SV）血管的直徑分別約為171 μm和157 μm。此外，BM3還能有效突出深層腦毛細(xì)血管，如圖10b（R2）所示，兩條毛細(xì)血管的直徑分別為75 μm和74 μm。

為進(jìn)一步展示BM3在腦血管造影中的優(yōu)勢(shì)和潛力，研究者建立了腦缺血再灌注小鼠模型。如圖10a和c所示，在主動(dòng)脈血管未受影響、血流通暢的假手術(shù)組和正常組中，BM3注射后清晰顯示了主要腦血管以及復(fù)雜密集交織的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)。圖像顯示出極其豐富和復(fù)雜的微血管結(jié)構(gòu)，凸顯了BM3在高分辨率血管成像方面的卓越能力。與之形成鮮明對(duì)比的是，缺血小鼠全腦出現(xiàn)顯著的血管熒光信號(hào)缺失，僅SSS、TS和ICV仍可見(jiàn)血流（圖10c）。其他區(qū)域熒光的缺失直接反映了腦灌注的中斷。再灌注后，部分腦血流恢復(fù)成功使許多血管重新顯影，尤其是SV等較大結(jié)構(gòu)。然而，與對(duì)照組相比，微血管網(wǎng)絡(luò)仍然嚴(yán)重受損，大量毛細(xì)血管變得模糊或完全消失。這可能是由于缺血引起的壞死或再灌注期間局部壓力導(dǎo)致微血管破裂所致。這些損傷導(dǎo)致熒光圖像中形成了明顯的"黑色區(qū)域"，即無(wú)血流區(qū)域，如果缺血時(shí)間延長(zhǎng)，這些區(qū)域有可能演變?yōu)槿毖�性壞死病變�?/span>

總之，本文通過(guò)簡(jiǎn)單的兩步合成法開(kāi)發(fā)了一類新型環(huán)稠合近紅外二區(qū)熒光染料（BM染料），其特點(diǎn)是具有卓越的亮度和穩(wěn)定性。其中，BM3作為最強(qiáng)大的候選染料，發(fā)射波長(zhǎng)約為920 nm，具有優(yōu)異的摩爾消光系數(shù)（ε = 3.7 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹）和量子產(chǎn)率（DMSO中ΦF = 18.4%）。這些數(shù)值超過(guò)了現(xiàn)有的近紅外二區(qū)熒光染料，標(biāo)志著該領(lǐng)域的重大進(jìn)展。體內(nèi)成像研究展示了BM3在多種生物學(xué)情境下的應(yīng)用潛力，尤其是在低濃度下（淋巴管為75 pmol）可視化生物組織微結(jié)構(gòu)的能力。值得注意的是，BM3能夠清晰監(jiān)測(cè)淋巴炎癥，揭示了對(duì)金黃色葡萄球菌感染的顯著反應(yīng)：與對(duì)照組相比，淋巴結(jié)腫脹和淋巴管擴(kuò)張分別增加了約2.5倍和1.8倍。更重要的是，BM3除了清晰勾勒出腦部主要血管和毛細(xì)血管外，它還能追蹤缺血再灌注過(guò)程中發(fā)生的血管損傷。這項(xiàng)工作不僅為生物研究引入了一個(gè)極具前景的近紅外二區(qū)熒光染料家族，也向染料化學(xué)研究人員推廣了一種簡(jiǎn)便的設(shè)計(jì)與合成方法，推動(dòng)近紅外二區(qū)熒光成像向臨床應(yīng)用邁進(jìn)。

 

參考文獻(xiàn)

Bian H, Ma D, Zhang X, et al. Bright, Robust and Readily Accessible Fluorophore Family for NIR-II Bioimaging[J]. Journal of the American Chemical Society, 2025, 147(43): 39936-39952.

 

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