RNA 作為一種重要的生物大分子，參與細(xì)胞生命代謝的整個(gè)過程，其代謝異常會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。 與相對(duì)穩(wěn)定遺傳的 DNA 不同，RNA 引起的改變是暫時(shí)的、非永久性的，但是 RNA 生物學(xué)的極度復(fù)雜性導(dǎo)致很難精確地將其靶向或編輯。目前靶向 RNA 的技術(shù)主要包括 RNAi 及 CRISPR-Cas13 技術(shù)等。

CRISPR/Cas13 系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)的能夠靶向 RNA 的 CRISPR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了 CRISPR 系統(tǒng)在病毒干擾方面的應(yīng)用。新發(fā)現(xiàn)的 Cas13 蛋白第四種亞型（Cas13d）的家族成員 CasRx 在體內(nèi)外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 RNA 裂解過程中顯示出更強(qiáng)的特異性和更高的敲除效率，而且 CasRx 比之前發(fā)現(xiàn)的所有亞型都要小很多，更容易利用 AAV 載體實(shí)現(xiàn)體內(nèi)遞送，在 RNA 編輯方面具有很大的應(yīng)用前景。

2016年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了可以靶向RNA進(jìn)行切割的CRISPR/Cas13系統(tǒng)，該系統(tǒng)由單一的效應(yīng)蛋白Cas13和CRISPR RNA（crRNA）組裝形成一個(gè)由crRNA引導(dǎo)的RNA靶向效應(yīng)復(fù)合物。目前，Cas13家族共鑒定出四種亞型，包括Cas13a（又名C2c2）、Cas13b、Cas13c和Cas13d，四種Cas13亞型蛋白分子量均小于Cas9蛋白。

所有Cas13蛋白均具有兩種不同的催化活性：

①由兩個(gè)較高等的真核和原核核苷酸結(jié)合（Higher eukaryotes and prokaryotes nuceotide-binding，HEPN）結(jié)構(gòu)域提供的RNase活性，這是靶RNA降解所必需的。Cas13 四個(gè)亞型同源性較低，且同源序列僅限于HEPN結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)，此外兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域中的單點(diǎn)突變會(huì)使CRISPR/Cas13系統(tǒng)對(duì)RNA的切割能力完全喪失；

圖1.CRISPR/Cas13系統(tǒng)介紹

②催化pre-crRNA加工和形成成熟crRNA的RNase活性。

與CRISPR II類系統(tǒng)的其它核酸酶結(jié)構(gòu)一致，Cas13a的整體結(jié)構(gòu)是雙葉的，N-末端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）和Helical-1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成crRNA識(shí)別葉（REC lobe），HEPN1、Helical-2、HEPN2結(jié)構(gòu)域形成核酸酶葉（NUC lobe）（圖2）。CRISPR/Cas13b系統(tǒng)有兩種酶，分別是VI-B1和VI-B2，它們之間的區(qū)別在于Cas13b轉(zhuǎn)座子上攜帶的附屬蛋白的基因型不同，VI-B1的附屬蛋白是Csx28，而VI-B2的附屬蛋白是Csx27。絕大多數(shù)Cas13d型系統(tǒng)還含有包含 WYL結(jié)構(gòu)域的相關(guān)輔助蛋白，WYL結(jié)構(gòu)域通常與原核防御系統(tǒng)有關(guān)（圖1）。

圖2.Cas13a蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖

所有的Cas13蛋白酶都需要60- 66 nt的crRNA來確保靶向特異性。四種亞型crRNA都有一個(gè)促進(jìn)與相應(yīng)Cas13蛋白酶結(jié)合的直接重復(fù)（Direct repeat，DR）以及特異性靶向轉(zhuǎn)錄本的間隔序列。Cas13b的crRNA在3’端攜帶直接重復(fù)，而Cas13a、c和d的crRNA在5’端攜帶直接重復(fù)（圖3）。