單細(xì)胞蛋白組Abseq聯(lián)合流式技術(shù)在解鎖腫瘤與感染免疫差異中的應(yīng)用
在科研領(lǐng)域，單細(xì)胞蛋白組技術(shù)憑借其精準(zhǔn)解析單個(gè)細(xì)胞蛋白表達(dá)特征的優(yōu)勢(shì)，成為探究免疫機(jī)制、挖掘疾病生物標(biāo)志物的核心工具。其中，Abseq單細(xì)胞蛋白組技術(shù)表現(xiàn)突出，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單細(xì)胞水平蛋白表達(dá)的高效、精準(zhǔn)檢測(cè)，為復(fù)雜疾病的機(jī)制研究提供關(guān)鍵支撐。在Nature的一項(xiàng)重要研究中，科研人員充分發(fā)揮Abseq單細(xì)胞蛋白組技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，結(jié)合流式分析技術(shù)，取得了突破性發(fā)現(xiàn)——成功鑒定出腫瘤特異的Treg細(xì)胞，并確定了其生物標(biāo)志物，這一成果為未來(lái)腫瘤靶向治療帶來(lái)了新的曙光。
值得一提的是，在這項(xiàng)研究中，Abseq單細(xì)胞蛋白組技術(shù)與流式分析技術(shù)發(fā)揮了關(guān)鍵作用，二者配合默契、相得益彰。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種技術(shù)相互驗(yàn)證，為研究結(jié)果提供了堅(jiān)實(shí)的支撐。其中還在單細(xì)胞RNA測(cè)序樣本處理環(huán)節(jié)，全部采用流式分選技術(shù)進(jìn)行樣本富集，這一操作不僅顯著提升了單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的精度，還有效節(jié)約了測(cè)序成本。而Abseq單細(xì)胞蛋白組技術(shù)與流式技術(shù)強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，為單細(xì)胞研究打造了一套全方位、多維度的解決方案，誠(chéng)邀廣大科研、臨床及工業(yè)領(lǐng)域的用戶(hù)踴躍試用！
接下來(lái)，詳細(xì)介紹這篇發(fā)表在Nature期刊上的文章——“Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation”。該研究對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）以及部位匹配的非惡性炎癥口腔粘膜（OM）的免疫特征展開(kāi)了系統(tǒng)性分析。研究過(guò)程中，科研人員發(fā)現(xiàn)了一群獨(dú)特的腫瘤特異Treg亞群。這群細(xì)胞具有顯著的免疫抑制特性，能夠?qū)CR信號(hào)做出應(yīng)答，并且處于活躍增殖狀態(tài)。更為重要的是，研究團(tuán)隊(duì)借助Abseq技術(shù)創(chuàng)新性地鑒定出了該亞群的生物標(biāo)志物，這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤精準(zhǔn)治療開(kāi)辟了全新的思路。
免疫療法在癌癥治療領(lǐng)域已取得了令人矚目的成功，然而，其發(fā)展之路并非一帆風(fēng)順，仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。其中，一個(gè)亟待解決的問(wèn)題是，免疫療法所靶向的通路并非腫瘤專(zhuān)屬，在其他組織微環(huán)境中同樣存在。盡管目前已有大量研究聚焦于腫瘤微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，但我們對(duì)腫瘤特異的免疫變化依然知之甚少，這在一定程度上限制了免疫療法在腫瘤治療中的精準(zhǔn)應(yīng)用和進(jìn)一步發(fā)展。
（1）單細(xì)胞蛋白組與RNA測(cè)序聯(lián)合技術(shù)
（2）流式分析技術(shù)
1. OM和HNSCC的免疫表型趨于一致
在腫瘤組織中，功能衰竭的T細(xì)胞和Treg細(xì)胞往往被視為抗腫瘤免疫反應(yīng)失效的關(guān)鍵因素，且T細(xì)胞的效應(yīng)功能與抗原呈遞細(xì)胞（APCs，Antigen Presenting Cells）緊密相關(guān)。為深入探究相關(guān)免疫機(jī)制，作者運(yùn)用兩組包含30個(gè)參數(shù)的高維流式panel，對(duì)OM和HNSCC組織及血液中的免疫細(xì)胞圖譜進(jìn)行了深度剖析。
研究結(jié)果令人意外，OM和HNSCC組織的免疫表型竟基本相似。在CD45+活細(xì)胞中，CD3+ T細(xì)胞、CD19+ B細(xì)胞以及CD56+ NK細(xì)胞的比例，還有CD4/CD8比例都大致相同（Fig 1a）。在APC細(xì)胞方面，cDC2s、DC3及CD16+非常規(guī)單核細(xì)胞的比例在OM和HNSCC組織中也基本一致，不過(guò)CD141+ cDC1s在HNSCC腫瘤組織中的比例略低（Fig 1b）。
為了精準(zhǔn)鑒定特定免疫亞群之間的差異，作者借助了FAUST這一機(jī)器算法。該算法能夠以無(wú)監(jiān)督的方式發(fā)現(xiàn)并注釋統(tǒng)計(jì)上相關(guān)的細(xì)胞表型。結(jié)果顯示，在T細(xì)胞panel中，HNSCC組織中富集了一個(gè)CD8+ T細(xì)胞亞群和四個(gè)CD4+ Treg亞群；在APC細(xì)胞panel中，HNSCC組織中富集了CD40及PD-L1共表達(dá)的CD14+細(xì)胞以及cDC2s、DC3細(xì)胞。
2. 分析腫瘤富集的APC與T細(xì)胞之間的細(xì)胞通訊
為進(jìn)一步探究上述免疫細(xì)胞的一致性與區(qū)別，作者采用了單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，不僅發(fā)現(xiàn)了與流式結(jié)果相一致的免疫表型，還鑒定出了腫瘤特有的轉(zhuǎn)錄特征和蛋白表達(dá)特征。隨后，作者運(yùn)用NicheNet方法對(duì)腫瘤特異性的T細(xì)胞和APC細(xì)胞通訊展開(kāi)了研究。
研究發(fā)現(xiàn)，HNSCC腫瘤T-APC細(xì)胞通訊中富集的配體受體相互作用情況如下：ICOS配體通過(guò)ICOS發(fā)揮作用，IL-18通過(guò)IL18-R1發(fā)揮作用，IL1B通過(guò)IL-1受體1型及2型發(fā)揮作用。
鑒于流式和單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）均顯示HNSCC腫瘤Tregs細(xì)胞存在差異，作者進(jìn)一步對(duì)Treg-APC的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)流式分析發(fā)現(xiàn)，IL1R1（在T細(xì)胞與APC通訊中富集）特異性地表達(dá)在腫瘤浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞上（Figure 2a）。幾乎所有的IL1R1+ T細(xì)胞都共表達(dá)ICOS、IL-18R1以及趨化因子受體CXCR6（Figure 2b）。
3. IL1R1+ Treg細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與蛋白組特征分析
為了更清晰地區(qū)分腫瘤浸潤(rùn)的IL1R1+ Treg細(xì)胞和IL1R1- Treg細(xì)胞，作者從OM、HNSCC以及外周血中分選了Treg細(xì)胞，并結(jié)合免疫響應(yīng)基因panel進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序。
結(jié)果顯示，腫瘤中的IL1R1+ Treg細(xì)胞（Figure 3a，橙色亞群）和IL1R1- Treg細(xì)胞（Figure 3a，藍(lán)色亞群）各自形成了獨(dú)立的亞群，與外周血Treg細(xì)胞存在明顯差異。在IL1R1+ Treg細(xì)胞中，選擇性富集了超過(guò)50個(gè)轉(zhuǎn)錄本（Figure 3b），其中包括TNFRSF18（編碼GITR）和TNFRSF9（編碼4-1BB）；這類(lèi)細(xì)胞在蛋白水平也呈現(xiàn)出特異性表達(dá)特征，表明IL1R1+ Treg細(xì)胞代表了腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞中一群具有獨(dú)特轉(zhuǎn)錄組特征的免疫亞群。
4. IL1R1+ Treg細(xì)胞高度抑制性的功能研究
在CD8+ T細(xì)胞及CD4+ T細(xì)胞的體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，IL1R1+ Treg細(xì)胞展現(xiàn)出了比IL1R1- Treg細(xì)胞更有效的抑制效果（Figure 4a）。另外，通過(guò)anti-CD3、anti-CD28和anti-CD2磁珠刺激，腫瘤浸潤(rùn)IL1R1+ Treg細(xì)胞中IL1R1的表達(dá)在第1天升高，第2-3天下降（Figure 4b）。這一現(xiàn)象提示，IL1R1+ Treg細(xì)胞能夠應(yīng)答TCR信號(hào)并調(diào)控IL1R1的表達(dá)。
為進(jìn)一步研究腫瘤浸潤(rùn)IL1R1+ Treg細(xì)胞應(yīng)答激活信號(hào)的免疫反應(yīng)，作者利用佛波酯（PMA）及離子霉素進(jìn)行短時(shí)間刺激，然后運(yùn)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合Abseq膜蛋白測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)分析了這類(lèi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組變化。對(duì)CD4+ T細(xì)胞及Treg細(xì)胞進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析后，結(jié)果顯示存在三個(gè)Treg亞群：IL1R1-、IL1R1+及活躍增殖的IL1R1+ Treg細(xì)胞。
PMA及離子霉素刺激后，Treg細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白及差異表達(dá)基因情況如圖Figure 5a-b所示。例如，這類(lèi)細(xì)胞高表達(dá)TNFRSF9及CTLA4轉(zhuǎn)錄本，并且通過(guò)Abseq技術(shù)檢測(cè)證實(shí)，其CTLA4蛋白顯著高表達(dá)。這表明IL1R1+ Treg細(xì)胞處于激活狀態(tài)且具有功能活性，并且存在一個(gè)活躍增殖的亞群。
通過(guò)Abseq單細(xì)胞膜蛋白檢測(cè)結(jié)果，作者成功鑒定出一組生物標(biāo)記物，能夠唯一地識(shí)別IL1R1+ Treg細(xì)胞。僅使用2個(gè)膜表面蛋白，就可以從組織和外周血所有CD45+的免疫細(xì)胞中標(biāo)記出這類(lèi)細(xì)胞。并且通過(guò)流式分析驗(yàn)證了標(biāo)志物的特異性：幾乎所有的CD45+IL1R1+ICOS+細(xì)胞都是Treg細(xì)胞（Figure 6a）。這一發(fā)現(xiàn)依托Abseq技術(shù)的精準(zhǔn)蛋白檢測(cè)能力，為未來(lái)靶向腫瘤特異性Treg細(xì)胞的治療提供了全新的思路和靶點(diǎn)。
最后，作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并結(jié)合公開(kāi)的scRNA-seq數(shù)據(jù)集（涵蓋19種不同的腫瘤類(lèi)型）分析發(fā)現(xiàn)，IL1R1+ Treg細(xì)胞并非僅特異性存在于HNSCC腫瘤中，而是以不同比例分布于各種實(shí)體腫瘤中。清除腫瘤浸潤(rùn)性Treg細(xì)胞被認(rèn)為是一種極具前景的抗腫瘤治療方法，而該研究借助Abseq技術(shù)鑒定出的腫瘤特異Treg細(xì)胞生物標(biāo)志物，為靶向腫瘤特異Treg細(xì)胞、同時(shí)不影響其他Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能提供了可能，為腫瘤免疫治療的精準(zhǔn)化發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
單細(xì)胞Abseq和流式檢測(cè)技術(shù)哪里有？
樂(lè)備實(shí)提供單細(xì)胞Abseq檢測(cè)和流式檢測(cè)服務(wù)，且Abseq數(shù)據(jù)可直接導(dǎo)入FlowJo分析。
樂(lè)備實(shí)（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司旗下全資子公司），是國(guó)內(nèi)專(zhuān)注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專(zhuān)家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。
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